吳曉雯，王鐵桿，劉 穎，張 鵬

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,溫州市海洋生物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省近岸水域生物資源開發(fā) 與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 溫州 325005)

0 引言

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，紅毛菜科(Bangiaceae)，法紫菜屬(Pyropia)[1]，是一種生長在潮間帶巖礁上的暖溫帶大型藻類，分布在浙江、福建和廣東，是我國特有的經(jīng)濟(jì)種類。目前我國壇紫菜栽培規(guī)模達(dá)24 863 hm2，年產(chǎn)量86 495 t，總產(chǎn)量占全國紫菜總產(chǎn)量的76%[2-3]。壇紫菜味美價(jià)廉，富含大量人體必需的蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，可供食用和藥用，有著“營養(yǎng)寶庫”的美稱。

從20世紀(jì)60年代初開始?jí)喜损B(yǎng)殖以來，大部分栽培品系仍由巖礁上采集的野生種馴化而來，過去10 a間在養(yǎng)殖實(shí)踐中僅有一次引入野生種。種內(nèi)頻繁自交和遺傳漂變導(dǎo)致種質(zhì)退化，使養(yǎng)殖的壇紫菜產(chǎn)量逐年下降,急需對(duì)壇紫菜種質(zhì)進(jìn)行純化、再生和遺傳改良[4]。物種的遺傳多樣性是其基因庫中遺傳信息的總和，將新的基因引入現(xiàn)有物種中可以提高其適應(yīng)性、養(yǎng)殖產(chǎn)量以及對(duì)疾病和環(huán)境的抵抗力[5]。因此，對(duì)野生壇紫菜資源開展遺傳多樣性研究具有重要意義。環(huán)境污染、水產(chǎn)養(yǎng)殖、堤壩建設(shè)等人類活動(dòng)對(duì)潮間帶生態(tài)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了重大影響，野生藻場資源受到威脅，但鮮有對(duì)野生壇紫菜遺傳多樣性研究的報(bào)道。因此，對(duì)現(xiàn)存的野生壇紫菜群體進(jìn)行資源調(diào)查和遺傳多樣性分析，可為其人工繁育所需的原始種質(zhì)資源提供參考。

分子標(biāo)記是檢測(cè)種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和變異的常用技術(shù)手段。目前，RAPD[6]、AFLP[7]、ISSR[8-9]、SSR[10-11]、SCAR[12]已用于壇紫菜遺傳多樣性的研究，但這些標(biāo)記存在一定的局限性，比如有的可重復(fù)性低，有的需較多人力和成本。日趨流行和成熟的測(cè)序技術(shù)則可提供更為準(zhǔn)確的核苷酸序列數(shù)據(jù)，如核糖體ITS-5.8S rDNA和葉綠體rbcL[13-15]等已廣泛應(yīng)用于藻類研究。線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(cytochrome c oxidase subunit I，COX)基因變異大，是研究群體遺傳變異的理想標(biāo)記。葉綠體中的光合作用第一關(guān)鍵酶——核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亞基，由葉綠體基因組編碼，簡稱rbcL。COX和rbcL基因經(jīng)常被用作條形碼標(biāo)記用于評(píng)估海藻的遺傳多樣性，包括隱藏物種的多樣性和群體結(jié)構(gòu)[16-20]，但它們還未被用于研究壇紫菜遺傳多樣性。

本研究使用COX和rbcL基因研究我國東南沿海的壇紫菜，旨在初步摸清我國東南沿海野生壇紫菜的遺傳多樣性特征，為野生壇紫菜保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的125株壇紫菜樣品于2017年至2019年分別采自浙江的臺(tái)州大陳島(DC)、溫州南策島(NC)、溫州樂清灣(YQ)、溫州竹嶼島(ZY)、溫州洞頭勝利岙(SL)、溫州洞頭桐岙(TQ)和溫州北麂小筲箕嶼(BJ)，福建的平潭島(PT)、莆田南日島(NR)和寧德北礵島(BS)，廣東的汕頭平嶼(PY)。除樂清灣和桐岙的紫菜樣品為養(yǎng)殖群體外，其余樣品均為野生群體，樣品信息見表1。將葉狀體洗凈晾干，密封保存于-20 ℃冰箱。

表1 壇紫菜樣品信息Tab.1 Sample information of Pyropia haitanensis

1.2 壇紫菜基因組DNA提取

用雙蒸水多次沖洗葉狀體，吸水紙吸干表面水分后使用植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，DN1401)提取總基因組DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，再通過微量分光光度計(jì)(Nano-400)測(cè)定DNA的質(zhì)量與濃度，于-20 ℃分管保存。

1.3 目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增和測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)參考NCBI相關(guān)序列自行設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物:COX-F:5’-GATGCTGTACCCGGTAGAT-3’,COX-R:5’-GTTGTAATTGTTTAGCTGTTTTT-3’，rbcL-F:5’-GACTCCAACAGCAAACATCTAG -3’,rbcL-R: 5’-TTAATAYCTAGCTCCTTCAGGC-3’。引物由上海生工生物有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系選用25 μL，其中包括：超純水9.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×A 8fasthifi PCR master(北京艾德萊生物技術(shù)有限公司)12.5 μL。PCR程序包括：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，退火15 s(COX基因49 ℃、rbcL基因52.5 ℃)，72 ℃延伸30 s(變性延伸35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃再延伸5 min。每次反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照以檢驗(yàn)是否有污染。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定PCR產(chǎn)物為目的基因序列后，送至杭州擎科生物有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用DNAstar 5.0軟件包中的Seqman對(duì)獲得的原始序列進(jìn)行拼接，并結(jié)合峰圖進(jìn)行人工校對(duì)。通過NCBI的Blast比對(duì)驗(yàn)證兩組數(shù)據(jù)(COX和rbcL)是否為目的基因序列。采用DNAsp 5.0[21]分析多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性，統(tǒng)計(jì)單倍型[22]。采用MEGA 6.0[23]計(jì)算堿基組成、簡約信息位點(diǎn)數(shù)和單堿基突變位點(diǎn)，根據(jù)Kimura兩參數(shù)模型(Kimura-2-Parameter, K2P)[24]計(jì)算群體間的遺傳距離以及單倍型遺傳距離。采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML法)構(gòu)建單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的支持度采用bootstrap方法進(jìn)行1 000次自檢。利用PopART 1.7[25]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，探討壇紫菜單倍型是否存在譜系結(jié)構(gòu)。采用R軟件進(jìn)行群體配對(duì)遺傳分化和地理距離的線性回歸分析和Mantel檢驗(yàn)。利用DNAsp5.0中Tajima’D檢驗(yàn)中性假說，驗(yàn)證東南沿海壇紫菜群體是否經(jīng)歷歷史擴(kuò)張[26]。使用Arlequin v3.5[27]進(jìn)行分子方差(AMOVA)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 堿基組成

本實(shí)驗(yàn)共獲得125條序列，經(jīng)過剪輯得到408 bp的COX基因片段和488 bp的rbcL基因片段。COX基因片斷的T、C、A、G含量分別為37.6%、13.8%、34.1%和14.5%，A+T含量為71.7%，符合線粒體組成特征。rbcL基因片斷的T、C、A、G含量分別為32.6%、15.2%、34.3%和17.9%。COX和rbcL基因片斷串聯(lián)后的長度為896 bp，T、C、A、G含量分別為34.9%、14.6%、34.2%和16.3%。

2.2 遺傳多樣性

COX基因片斷中有2個(gè)缺失位點(diǎn)，68個(gè)變異位點(diǎn)，其中單堿基變異位點(diǎn)17個(gè)，簡約信息位點(diǎn)51個(gè)。rbcL基因片斷中變異位點(diǎn)60個(gè)，其中單堿基變異位點(diǎn)2個(gè)，簡約信息位點(diǎn)58個(gè)。COX和rbcL基因片斷串聯(lián)分析檢測(cè)到變異位點(diǎn)128個(gè)，其中單堿基變異位點(diǎn)19個(gè)，簡約信息位點(diǎn)109個(gè)。

COX基因片斷顯示11個(gè)群體的單倍型多樣性為0.790 0±0.023 0；核苷酸多樣性為0.045 5±0.035 0，平均核苷酸差異度為18.269 0，Tajima’s D值為0.950 4(p>0.10)。rbcL基因片斷顯示11個(gè)群體的單倍型多樣性為0.477 0±0.047 0；核苷酸多樣性為0.028 4±0.023 1，平均核苷酸差異度為11.950 0，Tajima’s D值為0.710 3(p>0.10)。

COX和rbcL基因聯(lián)合片斷分析結(jié)果見表2。群體間單倍型多樣性最高的是大陳島(DC,0.972 0±0.064 0)，北礵島最低(BS,0.182 0±0.144 0)。核苷酸多樣性最高的是南策島(NC,0.026 4±0.028 6)，勝利岙最低(SL,0.000 3±0.000 4)。

表2 基于COX和rbcL基因聯(lián)合片段的壇紫菜11個(gè)群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 11 Pyropia haitanensis populations based on the concatenated COX and rbcL gene fragments

2.3 群體遺傳距離

基于COX和rbcL基因聯(lián)合分析的群體間遺傳距離見表3。遺傳距離范圍在0.000 3～0.111 0之間。平嶼(PY)和大陳島(DC)兩個(gè)群體間遺傳距離最大(0.111 0)，樂清灣(YQ)和桐岙(TQ)遺傳距離最小(0.000 3)。大陳島(DC)與其它群體的遺傳距離也較大。

表3 基于COX和rbcL基因聯(lián)合片段的壇紫菜11個(gè)群體遺傳距離Tab.3 Genetic distance between 11 Pyropia haitanensis populations based on concatenated COX and rbcL gene fragments

群體間遺傳距離和地理距離相關(guān)性檢測(cè)顯示二者具有線性相關(guān)性(R2=0.002 2，p=0.735 4)，群體遺傳距離隨地理距離的增大而增大，但沒有形成地理隔離(Mantalr=0.046 6，p=0.291 8)(圖1)。

圖1 基于COX和rbcL基因片斷的壇紫菜群體遺傳 距離和地理距離相關(guān)性分析Fig.1 The correlation between population genetic distances and geographical distance based on COX and rbcL gene fragments

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析結(jié)果顯示(表4)，壇紫菜群體間遺傳變異主要來自于群體間(83.960 0%，p<0.001 0)，群體內(nèi)的遺傳差異只占16.040 0%(p<0.001 0)。

表4 基于COX基因和rbcL基因的壇紫菜群體AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis based on concatenated COX and rbcL gene fragments

Tajima’s D值主要檢測(cè)目標(biāo)序列在進(jìn)化過程中是否遵循中性進(jìn)化模型。COX基因(Tajima’s D=2.295 1)和rbcL基因(Tajima’s D=3.095 6)的單獨(dú)分析，以及它們的聯(lián)合分析(Tajima’s D=2.687 1)結(jié)果顯示(表2)，總Tajima’s D為正值，壇紫菜的進(jìn)化方式為平衡選擇，且有單倍型分化，與單倍型檢測(cè)結(jié)果相符。

COX基因片斷檢測(cè)到25個(gè)單倍體，而rbcL基因片斷只檢測(cè)到8個(gè)單倍體。聯(lián)合分析的128個(gè)變異位點(diǎn)在125個(gè)壇紫菜個(gè)體中定義了31個(gè)單倍型(Hap1～Hap31)，上傳到GenBank獲得相應(yīng)的序列號(hào)(MW380389～MW380413, MW391915～MW391922)。其中Hap1、Hap10和Hap16為核心單倍型，分別占總個(gè)體的 32.8%、12.8%和24.8%。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)顯示單倍型分為三大支，Hap29連接了其中兩大支，可能是一個(gè)重要的單倍型。大陳島(DC)群體內(nèi)部分單倍型在網(wǎng)絡(luò)圖上獨(dú)立出來，但其它群體沒有明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。

以Pyropiayezonesis(COX: GenBank號(hào)KF561997.1；rbcL: GenBank號(hào)AB818919.1)和Paropiafucicola(COX: GenBank號(hào)KF561997.1；rbcL: GenBank號(hào)KJ776837.1)為外群，構(gòu)建的壇紫菜單倍型ML系統(tǒng)樹(圖3)顯示，所有壇紫菜與這兩種紫菜明顯分開，壇紫菜31個(gè)單倍型主要分為三大支，與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖相符。

圖3 基于COX和rbcL基因片段的壇紫菜31個(gè) 單倍型的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Maximum likelihood tree of 31 haplotypes based on COX and rbcL gene fragments (圖中各分支數(shù)字代表置信值，標(biāo)尺表示序列之間差異。) (Each branch number in theFigure represents a confidence value, and the scale indicates the difference between the sequences.)

3 討論

3.1 分子標(biāo)記選擇

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD[6]、AFLP[7]、ISSR[8-9]、SSR[10-11]、SCAR[12]等被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究。本次研究選擇了線粒體COX基因和葉綠體rbcL基因片段來分析壇紫菜遺傳多樣性，結(jié)果顯示COX基因片段的變異位點(diǎn)有68個(gè)，占比16.7%；rbcL基因片段的變異位點(diǎn)有60個(gè)，占比12.3%，這與其它紅藻(Gracilariavermiculophylla)研究相類似[28]。對(duì)于東南沿海壇紫菜，COX基因片斷單倍型多樣性為0.790 0±0.023 0，核苷酸多樣性為0.045 5±0.035 0；rbcL基因片斷單倍型多樣性為0.477 0±0.047 0，核苷酸多樣性為0.028 4±0.023 1，這兩個(gè)基因結(jié)果都高于紅藻[28]。在125個(gè)個(gè)體中，COX基因片斷檢測(cè)到25個(gè)單倍型，而rbcL基因片斷只檢測(cè)到8個(gè)單倍型，表明COX基因在群體核苷酸多樣性和單倍型分析時(shí)更有價(jià)值，該結(jié)果與YANG et al[28]研究結(jié)論相符。

3.2 壇紫菜遺傳多樣性

遺傳多樣性不僅是生物多樣性的內(nèi)在表現(xiàn)形式，還是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件，對(duì)生物多樣性的形成、發(fā)展或維持有重要影響[29]。群體中單倍型多樣性是評(píng)價(jià)該群體遺傳分化和多態(tài)程度的重要指標(biāo)之一，數(shù)值越大，群體遺傳多樣性越高。11個(gè)群體的核苷酸多樣性為0.035 9±0.028 4，單倍型多樣性為0.817 0±0.024 0，這種較高單倍型多樣性和較低核苷酸多樣性結(jié)果符合GRANT et al[30]提出的海洋生物遺傳多樣性的一般特征。大陳島(DC)群體共有9個(gè)個(gè)體，檢測(cè)到8個(gè)單倍型，占所有單倍型的25.8%，其單倍型多樣性和核苷酸多樣性明顯高于其它壇紫菜群體(表2)。大陳島隸屬于臺(tái)州，該地區(qū)是一個(gè)較好的野生壇紫菜種質(zhì)資源庫，但近幾年在海區(qū)采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的野生壇紫菜生物量明顯減少。因此，需要加大對(duì)該海區(qū)野生壇紫菜的保護(hù)力度，防止野生壇紫菜藻場的退化和衰竭。

ML系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖雖然呈現(xiàn)三大分支，有明顯的譜系結(jié)構(gòu)，但這些譜系的單倍型組成可能與其地理來源不完全匹配，各個(gè)群體間存在一定的基因交流，可能與異地?cái)U(kuò)散或引種有關(guān)。該結(jié)果和王金丹 等[9]通過微衛(wèi)星對(duì)浙南4個(gè)海域(蒼南鐵釘島、洞頭竹嶼島、南麂列島和溫嶺斜頭島)野生壇紫菜遺傳多樣性的研究類似，壇紫菜群體間群體遺傳分化水平較低。壇紫菜大部分為雌雄異體，繁殖方式主要為異交，在其生活史中果孢子及殼孢子都可以通過海流進(jìn)行長距離傳播。中國沿海同時(shí)存在南向和北向的兩種主要洋流，一是黑潮的支流，沿中國臺(tái)灣北上進(jìn)入東海,即臺(tái)灣暖流；二是季節(jié)性的浙閩沿岸流,在冬季和夏季分別自北向南和自南向北流動(dòng)，促使不同海區(qū)間的物質(zhì)循環(huán)和交流[31]。這些洋流使壇紫菜果孢子和殼孢子大范圍的漂移成為可能，可能促進(jìn)壇紫菜群體間的個(gè)體混雜，從而影響群體間的遺傳分化。

桐岙(TQ)和樂清灣(YQ)之間的遺傳距離最小，說明兩者親緣關(guān)系最近。這兩個(gè)群體皆來自于養(yǎng)殖群體，在育苗和生產(chǎn)過程中，可能存在不同品種的相互混雜。雖然兩個(gè)群體采自不同海域，但仍可能來自同一親本。長此以往，養(yǎng)殖壇紫菜品系容易退化，會(huì)對(duì)壇紫菜生產(chǎn)造成不利影響。因此，需要加強(qiáng)對(duì)壇紫菜養(yǎng)殖種質(zhì)資源的研究和保護(hù)。

綜上所述，本研究使用線粒體COX和葉綠體rbcL基因片段對(duì)我國東南沿海11個(gè)壇紫菜群體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)壇紫菜遺傳分化水平較低。在目前野生壇紫菜種質(zhì)資源保護(hù)尚好的情況下，應(yīng)重視對(duì)關(guān)鍵種質(zhì)資源的收集、保存和保護(hù)，為壇紫菜新品系的培育提供優(yōu)良材料和理論支持。

致謝感謝兩位審稿專家對(duì)本文提出的寶貴意見。