宋曉東,馬文麗,趙 媛

(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500)

赭曲霉毒素(ochratoxins)是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的一類化合物，依其發(fā)現(xiàn)順序分別稱為赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC),其中以赭曲霉毒素A的分布最廣泛，毒性最強(qiáng)，對(duì)人類和動(dòng)物的危害最大[1]。主要以污染小麥、玉米、大米等農(nóng)作物為主[2]。

目前，檢測(cè)飼料中赭曲霉毒素A殘留的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等[3-9]。其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快和成本低的優(yōu)點(diǎn)；可以高通量的對(duì)大量樣品進(jìn)行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定量測(cè)定，以確定樣品中待測(cè)組分的含量。

本研究對(duì)于市售不同品牌酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒在線性關(guān)系、回收率、精密度和抗干擾等方面檢測(cè)玉米粉中赭曲霉毒素A殘留對(duì)比，為乳制品企業(yè)選擇快速篩查飼料方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AL204電子天平，梅特勒-托利多(中國)公司；A11basic研磨儀，德國ZKA公司;ELx808酶標(biāo)儀;15R高速冷凍離心機(jī);2000237電熱恒溫培養(yǎng)箱；MS3 basic振蕩器；N-EVAP 112氮吹儀；BRAND(10～100)μl、(100～1 000)μl單道移液器、(30～300)μl多通道移液器;25 ml移液管、50 ml移液管。

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度>99.5%；甲醇，分析純；磷酸，分析純；二氯甲烷，分析純；正己烷，分析純。

赭曲霉毒素A ELISA檢測(cè)試劑盒,品牌M試劑廠家；赭曲霉毒素A ELISA檢測(cè)試劑盒,品牌E試劑廠家；赭曲霉毒素A ELISA檢測(cè)試劑盒,品牌P試劑廠家。

1.2 樣品制備

準(zhǔn)確稱取樣品后，按照不同品牌試劑盒的前處理方法及操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1品牌M試劑樣品制備方法

(1)粉碎并稱取4.0 g有代表性的樣本置入50 ml離心管中，加入60%甲醇20 ml與其混合。

(2)于振蕩器上劇烈振蕩10 min，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

(3)于4 000 r/min離心5 min。

(4)取上清100 μl加入900 μl樣本稀釋液，振蕩5 s，取50 μl用于分析。

1.2.2品牌E試劑樣品制備方法

(1)取大約50 g樣品磨成粉末狀，取5 g樣品于干凈試管中，加10 ml 0.5 mmol/L磷酸溶液，充分混合10 min。

(2)加20 ml二氯甲烷，3 000 g，離心10 min。

(3)去除上層磷酸層，旋渦混合溶液，3 000 g，離心10 min。

(4)取下層溶液(二氯甲烷層)用濾紙過濾，吸取12 ml濾液，50℃氮流蒸發(fā)。

(5)殘留物溶解于1.5 ml的試劑盒自帶抽提緩沖液A中。

(6)加2 ml正己烷，混合1 min，3 000 g，離心10 min，去除上層正己烷層。

(7)吸取50 ml下層清夜與200 ml稀釋緩沖液，混合均勻，吸取50 ml用于檢測(cè)。

1.2.3品牌P試劑樣品制備方法

(1)將樣品研磨成粉末,稱取20 g研磨的樣品，加入100 ml萃取劑(70%甲醇),渦旋混合至少2 min。

(2)待混合物中的顆粒沉淀后，定性濾紙過濾5～10 ml萃取液，收集濾液，取50μL濾液直接用于檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

根據(jù)不同品牌赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,并用試劑盒專業(yè)的分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g陰性玉米粉樣品12份,分成3組，每組4份，于每組中分別加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行3個(gè)不同濃度范圍的加標(biāo)試驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每種試劑盒檢測(cè)樣品的回收率。

1.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g陰性玉米粉樣品20份,向其中加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，配制成5 μg/kg濃度水平樣品，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每種試劑盒檢測(cè)樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.6 抗干擾試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g陰性玉米粉樣品6份,分成3組，每組2份，于每組中加入抗生素類、摻假物、混合毒、金屬元素(鈣、鎂、鈉元素)等干擾物質(zhì)，并于每組樣品中其中1份樣品加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品配制成5 μg/kg濃度水平樣品，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每種試劑盒檢測(cè)樣品的干擾物回收率。

1.7 適用性試驗(yàn)

采用3種品牌試劑盒對(duì)配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料3種不同飼料，在2、5、10 μg/kg 3個(gè)添加濃度水平進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每種試劑盒檢測(cè)樣品的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.8 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

選取陰性玉米粉樣品,向其中加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，配制成10 μg/kg濃度水平樣品，分別采用前述3種品牌試劑盒和GB/T 30957—2014飼料中赭曲霉毒素A的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，每種樣品重復(fù)檢測(cè)6次，比較3種品牌試劑盒檢測(cè)方法和高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量限及線性關(guān)系

根據(jù)不同品牌試劑盒檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)信息可知，品牌E、P試劑盒相關(guān)系數(shù)R2均大于0.96，且定量限均為1.5 μg/kg，具有良好的線性關(guān)系，定量限及線性關(guān)系對(duì)比如表1。

表1 定量限及線性關(guān)系對(duì)比

2.2 回收率

選取陰性玉米粉樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度范圍的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6次，經(jīng)計(jì)算得出不同加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。加標(biāo)濃度為2～10 μg/kg時(shí)，品牌M試劑盒檢測(cè)的回收率為5%～174%；品牌E試劑盒檢測(cè)的回收率為4%～86%；品牌P試劑盒檢測(cè)的回收率為96%～124%，由此可知，品牌P試劑盒檢測(cè)回收率較好，滿足檢測(cè)要求。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(n=6)

2.3 精密度

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=20)

選取陰性玉米粉樣品進(jìn)行同一濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)20次，經(jīng)計(jì)算得出各個(gè)試劑盒檢測(cè)樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。加標(biāo)濃度為5 μg/kg時(shí)，品牌M試劑盒檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為110.5%；品牌E試劑盒檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為11.6%；品牌P試劑盒檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為7.9%，由此可知，品牌P試劑盒檢測(cè)精密度較好，滿足檢測(cè)要求。

2.4 抗干擾

選取陰性玉米粉樣品進(jìn)行相同濃度加標(biāo)試驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6次，經(jīng)計(jì)算得出同一加標(biāo)干擾物回收率結(jié)果如表4所示。加標(biāo)濃度為5 μg/kg時(shí)，品牌M試劑盒檢測(cè)的干擾物回收率為45%；品牌E試劑盒檢測(cè)的干擾物回收率為65%；品牌P試劑盒檢測(cè)的干擾物回收率為79%，由此可知，品牌P試劑盒檢測(cè)干擾物回收率較好，滿足檢測(cè)要求。

表4 抗干擾試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(n=6)

2.5 適用性

選取3種不同飼料進(jìn)行3個(gè)不同濃度范圍的加標(biāo)試驗(yàn)，按照不同品牌試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6次，經(jīng)計(jì)算得出不同加標(biāo)回收率結(jié)果見表5。

加標(biāo)濃度為2～10 μg/kg時(shí)，品牌M試劑盒檢測(cè)配合飼料的回收率為15%～84%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為25%～95%,檢測(cè)濃縮飼料的回收率為8%～78%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為15%～115%,檢測(cè)精料補(bǔ)充料的回收率為20%～88%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為15.3%～88%；品牌E試劑盒檢測(cè)配合飼料的回收率為26%～98%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.8%～10.3%,檢測(cè)濃縮飼料的回收率為34%～83%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.5%～22%,檢測(cè)精料補(bǔ)充料的回收率為12%～89%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%～16.5%；品牌P試劑盒檢測(cè)配合飼料的回收率為98%～112%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%～8.1%,檢測(cè)濃縮飼料的回收率為98%～106%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%～8.8%,檢測(cè)精料補(bǔ)充料的回收率為109%～129%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～8.7%；由此可知，品牌P試劑盒檢測(cè)回收率較好，均在98%～129%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，滿足檢測(cè)要求。

因此，品牌P試劑盒檢測(cè)方法適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料等3種不同飼料中赭曲霉毒素A含量的測(cè)定。

表5 適用性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(n=6)

2.6 準(zhǔn)確性

選取陰性玉米粉樣本，分別采用高效液相色譜法和前述3種品牌試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，每種方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，并取平均值，計(jì)算每種試劑盒方法與高效液相色譜法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表6。品牌M試劑盒方法檢測(cè)結(jié)果與HPLC方法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為39.2%，品牌E試劑盒方法檢測(cè)結(jié)果與HPLC方法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%，品牌P試劑盒方法檢測(cè)結(jié)果與HPLC方法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%，由此可知，品牌P試劑盒方法準(zhǔn)確性較好。

表6 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(n=6)

3 結(jié)論

通過對(duì)3種不同品牌酶聯(lián)免疫吸附法試劑的研究，發(fā)現(xiàn)品牌P試劑在測(cè)定本研究原料中赭曲霉素A時(shí)，方法靈敏度高，線性關(guān)系較好，回收率穩(wěn)定，精密度較好，抗干擾性強(qiáng)，適用范圍廣，可以作為乳制品企業(yè)快速篩選飼料中赭曲霉毒素A的一種定量檢測(cè)方法。