張安東 劉華蔚 李永鋒 徐 娟 胡 敏

周圍神經(jīng)缺損的修復一直以來都是醫(yī)學中的一個亟需攻克的難題[1]。對于長段神經(jīng)缺損的病例來說，無法做到無張力縫合，自體神經(jīng)移植是金標準，但是自體神經(jīng)的來源有限，并且易引起神經(jīng)供區(qū)瘢痕、神經(jīng)瘤的形成和運動感覺障礙。此外，自體靜脈移植以及殼聚糖導管移植等方法在臨床均有應用，但神經(jīng)功能的恢復不太理想[2，3]。脫細胞血管基質具有獨特復雜的三維管狀結構，可為神經(jīng)再生提供一個良好的通道，且有利于細胞的黏附與增殖，經(jīng)過脫細胞處理后后，生物相容性良好[4]，是一種理想的神經(jīng)修復導管。迄今為止，關于血管脫細胞方法已有許多研究，存在一些問題如制備時間長，血管在離體后易發(fā)生降解，失去原有的管腔結構；細胞毒性殘留；力學結構破壞，機械性能差等[5]?；瘜W除垢劑如Triton、SDS 已被證實會殘留細胞毒性及破壞血管支架的力學結構[6，7]。超高壓作為在組織工程領域內的一項較新的技術，已被少量學者用于制備脫細胞血管支架[8-10]。糜蛋白酶與其他酶類相比，脫細胞效果強，對組織結構影響較小[11]。本研究旨在研究超高壓復合酶法制備脫細胞血管基質，并與本課題組前期兔頸動脈脫細胞方法[12]比較，尋求更簡單、理想的脫細胞方法。

1. 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供雌性的新西蘭白兔10 只(體重2～2.5kg)，許可證號SCXK(京)2015- 0005，實驗過程始終遵循動物倫理學要求。

1.1.2 試劑與儀器 糜蛋白酶(北京華越洋生物科技)，RNaseA(Sigma，美國)，DNase- I(Sigma，美國)，曲拉通X- 100(tritonX- 100，美國sigma公司)，Quant- iTTMDNA 檢測試劑盒(Invitrogen美國)，羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成)4%多聚甲醛溶液(上海太平洋化集團試劑廠)，蘇木素復染劑(邁新福州生物技術開發(fā)公司)，D- hanks 液(實驗室配制)，PBS 緩沖液(實驗室配制)，Hoechst33258熒光染料(Sigma，美國)，乙二胺四乙酸(EDTA，美國Sigma 公司)，胰蛋白酶/ 乙二胺四乙酸(2.5%trypsin- EDTA，美國Gibco 公司)，十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)(美國sigmaaldrich 公司)，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF，中國solarbio 公司)，青霉素/ 鏈霉素(美國hyClone 公司)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實業(yè)有限公司)，AxioZoom.V16 型立體顯微鏡(德國carlZeiss 公司)，BX51 型顯微鏡(日本olympus 公司)，MS260 型電子天平(上海電子天平一廠)，超高壓生物處理器(HPP- 400/ 1 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司)，常規(guī)手術縫線、器械，顯微器械以及速眠新、氯胺酮等注射藥物均由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 脫細胞血管的制備方法

1.2.1 兔頸總動脈的獲取 在麻醉、無菌條件下，取出兔頸總動脈，立即置于含有雙抗的無菌PBS 液中。用無菌PBS 液沖洗血管及管腔直到完全去除血液及雜質，用顯微手術器械去除血管外的結締組織和脂肪成分，去除血管外膜。截取長度為3cm、無明顯分支、內徑約3mm 的動脈30 根作為實驗材料，并將材料分為3 組，即對照組(新鮮血管)；實驗組：1(化學法+ 酶法)組，2(超高壓+ 酶)組，每組各10 根血管。

1.2.2 脫細胞血管基質的制備 化學法+ 酶法組：用蒸餾水處理24h 后，0.125%Trypsin-EDTA 消化4h，PBS 沖洗3 遍。加入1%TritonX-100(加入1μmol/ L PMSF+0.02%EDTA)40ml 作用24h，PBS 沖洗至無泡沫。蒸餾水再處理12h(每隔6h 換液)，隨后加入1%SDS(1μmol/ LPMSF+0.02%EDTA)40ml 作用24h，PBS 沖洗至無泡沫。用DNA 酶/ RNA 酶作用24h，最后蒸餾水處理12h(每隔6h 換液)。整個過程中均放置于37℃恒溫搖床上持續(xù)作用。冷凍干燥保存。

超高壓+ 酶法組：將血管以無菌PBS 液反復沖洗洗凈后，和無菌PBS 溶液一起密封入特制塑料袋中。將塑料袋置入超高壓生物處理機(HPP-400/ 1 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司)中，500MPa，4℃條件下處理5 次，每次在壓力達到500MPa 時，保持1 分鐘，隨后泄壓，壓力驟降為0Pa，然后立即升壓至500MPa，如此循環(huán)。處理結束后無菌條件下將取出血管。將血管置入含1%糜蛋白酶和20ug/ mlRNaseA、200ug/ mlDNaseI 的離心管中，垂直置于37℃恒溫搖床，在37℃的條件下反應14h，用pbs 震蕩沖洗2h。

兩組血管脫細胞處理后和對照組新鮮血管一起均冷凍干燥保存。

1.3 組織學觀察

①HE 染色(觀察細胞殘留)

標本固定(4%多聚甲醛)24h →80%- 100%乙醇梯度脫水→二甲苯兩次透明→浸蠟3h(更換3 次石蠟)→石蠟包埋(65℃)→切片(厚度約4μm)。石蠟切片二甲苯脫蠟2 次，每次5min→無水乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min，自來水沖洗3min，蒸餾水洗2min→蘇木素染液10min，自來水沖洗2min→1%鹽酸分化液分化數(shù)秒，提插數(shù)下，自來水沖洗3min→返藍液返藍/ 伊紅5min，自來水沖洗3min→80%乙醇脫水1min→90%乙醇脫水2 次，每次2min→無水乙醇脫水2 次，每次2min→二甲苯Ⅰ透明5min→二甲苯Ⅱ透明7min→中性樹膠封固，鏡檢。

②EVG 染色：在計算機上運用Image- pro Plus 軟件觀察，EVG(×400)染色切片，在圖片上打整齊均勻排列的十行十列一百個點，然后分析一百個測試點，其中測試點黑色表示彈性纖維，粉紅色點表示膠原纖維。進行分析后，計算每種組分的相對體積分數(shù)。

1.4 DNA 和羥脯氨酸含量的測定

1.4.1 DNA 含量測定 利用Quant- iTTMDNA檢測試劑盒分別測定對照組新鮮血管和實驗組各組脫細胞血管材料殘留DNA 含量的變化。

1.4.2 羥脯氨酸含量的測定 利用羥脯氨酸檢測試劑盒及多功能光度計分別測定對照組新鮮血管和實驗組各組脫細胞血管材料羥脯氨酸含量的變化。

1.5 最終抗張強度 將脫細胞血管基質修剪成寬度約5mm 的環(huán)狀，縱向剪開后得到以血管周徑為縱軸的條狀材料。將條狀材料的兩端用生物拉力機的樣品夾固定，滑塊牽動樣品夾反向運動,直至材料斷裂，重復測量各處理組材料樣品并記錄每次材料斷裂時的張力，用tremax 軟件在計算機上生成拉力圖形。

1.6 統(tǒng)計學分析 運用SPSS17.0 單因素方差分析比較，組與組之間比較采用q 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2. 結果

2.1 組織學觀察 HE 染色結果顯示：從染色結果來看2 組處理均能將細胞去除干凈，并且纖維成分保留完整，未見明顯區(qū)別，僅保留了細胞外基質,主要成分是膠原和彈性纖維，纖維連續(xù)沒有發(fā)生斷裂，排列整齊，無明顯的水腫。

圖1 HE 染色低、高倍鏡觀察(×100)(×200)

圖2 EVG 染色低、高倍鏡觀察(×100)(×200)

EVG 染色：觀察膠原纖維(見表1)和彈性纖維(見表2)的含量情況。

表1 脫細胞血管的膠原纖維含量(%)(x±s)

表2 脫細胞血管的彈性纖維含量(%)(x±s)

2.2 DNA 及羥脯氨酸含量

化學+ 酶法與超高壓+ 酶法組的DNA 含量與新鮮血管相比明顯減少，且均低于1.0ug/ g，說明兩種脫細胞方法制備的脫細胞血管基質的細胞成分已經(jīng)去除。對照組(新鮮血管)和化學+ 酶法與超高壓+ 酶法組的羥脯氨酸含量無明顯差異(P＜0.05)。

表3 DNA 及羥脯氨酸含量的測定

2.3 力學性能測試 實驗組脫細胞血管的最終抗張強度測試見過見表4。

表4 最終抗張強度及曲線

A：化學法+ 酶組

B：超高壓+ 酶組

C：新鮮血管

3. 討論

當今，由于車禍、戰(zhàn)爭、手術等原因，周圍神經(jīng)缺損的患者數(shù)量快速增長，其中長段神經(jīng)缺損的患者約占35%，由于此類患者無法進行直接的無張力縫合，而作為金標準的自體神經(jīng)移植又有諸多限制，因此臨床上亟需可用于修復大段神經(jīng)缺損的材料。周圍神經(jīng)的修復主要集中在如何讓再生的神經(jīng)長得“快”與長得“準”上，神經(jīng)導管不應只是簡單的為神經(jīng)修復再生提供一個暢通無阻的通道，還需有如物質交換功能、細胞因子梯度緩釋、利于細胞粘附等的功能[13]。脫細胞血管支架，其復雜的三維結構和良好的細胞親和力使得其在作為神經(jīng)修復導管時具有獨特的優(yōu)勢，所以維持脫細胞血管支架的三維結構和生物相容性是制備支架過程中的重點。目前國內外常用的脫細胞方法包括:機械法，酶消化法，化學去垢劑法等。以上幾種方法各有利弊，物理的方法對支架結構的破壞較小但脫細胞效果較差，而化學去垢劑方法脫細胞效果較好卻容易破壞血管的膠原結構[14]。另外，在利用TritonX-100 或SDS 等制備生物材料時，去垢劑的殘留會導致脫細胞生物材料具有一定程度的細胞毒性。需要較長時間的浸泡和漂洗，增加了制作過程中的污染機會。陸軍[15]等在實驗中明確了胰蛋白酶可以嚴重破壞血管支架的基質結構。糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強、毒性低、不良反應小。Wang F[10]通過比較發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶的脫細胞效果要優(yōu)于胰蛋白酶，且對脫細胞血管基質結構無明顯破壞。核酸酶由于其對DNA/ RNA 的特異性，不會對血管的蛋白結構造成影響。

超高壓生物處理技術早期應用在食品及制藥領域，用于對食品和藥品的滅菌。國內外已有少量學者將超高壓技術用于制備脫細胞血管基質，并已經(jīng)證明了超高壓對細胞裂解的促進作用，同時組織學檢測和力學性能測試表明，超高壓對脫細胞血管基質的結構和性能影響較小[8，9]，但是關于制備脫細胞血管支架的最佳參數(shù)，尚未有明確的定論。

本實驗中，本課題組首創(chuàng)了“升壓- 降壓”循環(huán)，短時間、多次數(shù)的超高壓生物處理方法，利用超高壓在脫細胞血管支架上釋放和消失時的“膨脹- 收縮”原理，使細胞在此過程中更充分的裂解，通過瞬間將一定數(shù)值的超高壓施放在支架上，作用1 分鐘后，瞬間降壓，直至為零，如此反復。并聯(lián)合使用了超高壓+1%糜蛋白酶+ 核酸酶的方法制備脫細胞血管支架，并與課題組前期的0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶脫細胞方法比較。DNA 及羥脯氨酸含量的測定的結果顯示，兩種方法均能完全去除血管的細胞成分，并且對血管膠原纖維沒有明顯破壞。從時間上來看，化學法+酶法(對照組)約用時124h，超高壓+ 酶法(實驗組)僅用時約17h。HE 染色結果顯示：化學法+ 酶法組血管中膠原纖維形態(tài)不規(guī)則，呈波浪形，纖維間出現(xiàn)空隙，而超高壓+ 酶法組血管膠原纖維連續(xù)無斷裂，排列致密，形態(tài)規(guī)則，說明了0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶的方法會對血管支架力學結構產生影響。EVG 染色測定了2 組脫細胞血管的膠原纖維及彈性纖維的量，且含量均為超高壓+ 酶法＞化學法+ 酶法,P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。同時在最終抗張強度實驗中，超高壓+ 酶法組的血管支架表現(xiàn)出了更優(yōu)良的拉伸性能。

綜上，本實驗證明了超高壓復合1%糜蛋白酶及核酸酶的方法，脫細胞效果良好，與前期的0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶的方法相比，對血管支架的纖維的量與質的影響較小，且用時較短，是一種更簡潔、實用的制備脫細胞血管支架的方法。