李秀金，王金輝，黃運茂，張續(xù)勐*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510225）

中國是世界最早飼養(yǎng)豬的國家之一，復雜遼闊的國土和多年的選育使我國具有豐富的地方豬種資源。中國地方豬種除了適應當?shù)貧夂颦h(huán)境外，也兼具優(yōu)良的肉質(zhì)性狀，但普遍存在產(chǎn)肉量較低、生長較慢等問題?！吨袊笄葸z傳資源志》（豬志）的數(shù)據(jù)顯示，西方瘦肉型豬瘦肉率在60% 以上，而中國地方豬的瘦肉率則大多在40% 左右。多年來，不同豬種肌肉發(fā)育的差異調(diào)控機制一直是動物遺傳領域的研究熱點。

除基因表達調(diào)控外，表觀修飾也是決定動物性狀的重要調(diào)控機制。表觀修飾是指在細胞核DNA 中核苷酸序列沒有改變的情況下，基因功能可逆、可遺傳的改變，這些改變包括DNA 修飾（如DNA 甲基化修飾）、組蛋白修飾（如組蛋白甲基化、乙?；┖蚏NA 干擾等[1]。哺乳動物在胚胎期組織發(fā)育發(fā)生劇烈變化的同時也伴隨著劇烈的表觀修飾變化，而這些表觀修飾的變化和關鍵基因的表達相互調(diào)控，對胚胎的正常發(fā)育和出生后的性狀具有重要作用[2]。本文結(jié)合研究團隊近年來的研究，介紹了DNA 甲基化對哺乳動物胚胎期肌肉發(fā)育的影響及不同豬種骨骼肌DNA 甲基化的研究進展，并對利用表觀遺傳手段提高中國地方豬種產(chǎn)肉量的方法進行展望。

1 豬骨骼肌發(fā)育的基本過程

豬胚胎期骨骼肌有2 輪發(fā)育過程：①初級肌纖維的形成階段：豬妊娠后第14～22 天經(jīng)歷體節(jié)-軸旁中胚層-生肌節(jié)的發(fā)育過程，初級肌纖維在妊娠后第35 天左右開始形成，并在妊娠第49 天左右達到增殖頂峰，這一過程一直持續(xù)到妊娠第60 天。②次級肌纖維形成階段：大約在豬妊娠第45～90 天，次級肌纖維圍繞初級肌纖維形成并分化發(fā)育，這個過程在妊娠第75 天左右達到頂峰，妊娠第91 天后肌纖維數(shù)目幾乎不再改變[3-5]。這一現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在牛、雞等動物中，即肌纖維總數(shù)在胚胎期或孵化時（雞）就已經(jīng)確定（圖1）[6]。肌纖維在出生后主要進行成熟過程，該過程主要涉及到肌纖維肥大及類型的變化[7]。因此，豬胚胎期骨骼肌的2 輪發(fā)育直接決定了肌纖維形成總數(shù)，進而對出生后產(chǎn)肉性狀尤其是瘦肉量起著決定性作用。

2 DNA 甲基化對胚胎早期骨骼肌發(fā)育的影響

在英國科學家沃丁頓提出的表觀遺傳模型中，將細胞的命運決定過程比喻成一個球體從山頂向下滑落的過程，山體不同地形決定了球體的走向，而這個地形就是表觀修飾。球體從山頂?shù)缴较?，從多能性到特異細胞類型，?jīng)歷了多重表觀修飾以及基因表達的相互調(diào)控所觸發(fā)的時間、空間的精密調(diào)控過程，確保胚胎在合適的時間和地點，形成正確的特異性分化的細胞群體，進而形成不同組織（圖2）[8]。

在脊椎動物中，DNA 甲基化主要出現(xiàn)在CpG 二分體的C 位點，它受到DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）家族的催化。在這個家族當中，DNMT1 主要的功能是在復制過程中保持DNA 甲基化狀態(tài)。而與此相反，DNMT3A 和DNMT2B 則是從頭甲基化酶，用來進行基因組甲基化特征的構(gòu)建。這3 個酶都是發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子，它們中任何一個缺失都會導致小鼠胚胎致死或者出生后不久死亡[9]。近年來，一些激活DNA 去甲基化過程的機制也被報道，包括移除甲基化的堿基或者通過DNA 修復后的脫氨基或者氧化作用。TET 家族是指能夠酶催化甲基化的C（mC）氧化成羥甲基化的C（hmC），最后變成甲酰化和羧基化的C 的蛋白家族，進一步支持了DNA 去甲基化過程中DNA 修復的作用[10]。

DNA 甲基化的重編程在人和小鼠的胚胎發(fā)育過程中均有報道[11]。受精后，大多數(shù)DNA 甲基化印跡被擦除，而著床后DNA 甲基化會迅速上升[12]。著床后獲得甲基化的基因主要參與了胚胎早期發(fā)育的生物學過程，而著床后失去甲基化的基因則主要參與了組織特異分化的生物學過程中（圖3）[2]。前期對豬原始生殖細胞的DNA甲基化研究中發(fā)現(xiàn)，與人、小鼠類似，豬原始生殖細胞的DNA 甲基化水平也出現(xiàn)了顯著變化：在妊娠15 d 著床前后，出現(xiàn)了劇烈的DNA 甲基化下降的現(xiàn)象，在妊娠20 d 達到最低點，此后開始上升[13]。

增強子能增加其連鎖基因的轉(zhuǎn)錄頻率，也是重要的表觀修飾形式之一。有研究顯示，MyoD啟動子上游20 kb 的核心增強子對MyoD在小鼠胚胎合適的時空表達起到了關鍵作用[14]。在小鼠胚胎中敲除這段增強子將會導致MyoD的表達晚1～2 d，進而引起成肌進程延遲1～2 d[15]。在小鼠胚胎和成肌細胞系中，MyoD的核心增強子是幾乎完全去甲基化的，而在非肌肉細胞系和非肌肉組織中，增強子的甲基化程度則處于較高的狀態(tài)（圖4）[16]。

3 不同豬種骨骼肌發(fā)育的DNA 甲基化

目前已有多種檢測分析基因組層面DNA 甲基化的測序方法，例如全基因組甲基化測序（WGBS）、還原亞硫酸氫鹽測序（RRBS）[17-18]、甲基化DNA 免疫沉淀測序（MeDIP-seq）[19]、甲基結(jié)合域測序（MBD-seq，MethylCap-seq）[20-21]和BeadChip array[22]等。然而，RRBS 在MspI 酶切和片段大小選擇的過程中減少可研究的基因組比例，其在組織樣品中的分析效率較低，并且需要較深的測序深度[23]。MeDIP-seq 則受限于需要基于前人的研究來設計探針，并且不能掃描甲基化程度較低的區(qū)域和重復區(qū)域[24]。將DNA 通過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后再進行高通量測序可使DNA 甲基化的檢測精確到單堿基水平，該方法近年來已成為甲基化研究的最佳方法之一?？偟膩碚f，利用WGBS 法研究DNA 甲基化最準確、分辨率最高。

最近幾年，已有科學家利用不同方法對不同品種豬不同組織的甲基化情況進行了研究。Li 等[25]利用MeDIP-seq 法研究了3 個品種豬不同部位的脂肪和骨骼肌，發(fā)現(xiàn)品種間、性別間和解剖學位置間存在DNA甲基化的相似性和特異性，并且鑒定了差異甲基化區(qū)域。使用熒光標記甲基化敏感擴增基因多態(tài)性方法（F-MSAP）對成年豬肌肉、心臟、肝臟、腎、肺和胃DNA 甲基化進行的研究發(fā)現(xiàn)，不同組織間DNA 甲基化的變化與組織發(fā)育過程中特定基因的表達有關[26]。在利用MeDIP-seq 法對瘦肉型、脂肪型、小型豬DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組進行聯(lián)合分析的研究中，Wu 等[27]研究發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化可能通過調(diào)控骨骼肌中基因的表達影響豬肥胖和體型大小的趨勢。導致產(chǎn)肉量不同的豬種胚胎早期肌肉發(fā)育差異的調(diào)控機制目前依然不明晰。由于胚胎著床后的早期胚胎發(fā)育時期對于組織分化過程十分關鍵，且經(jīng)歷了劇烈的DNA 甲基化變化，因此關注于這一時期的DNA 甲基化研究有望揭示導致產(chǎn)肉量不同的豬種肌肉發(fā)育和基因表達模式差異的原因。

作者所在團隊通過對五指山和長白豬的DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析證實了DNA 去甲基化酶Tet1在分離的豬胚胎成肌細胞和C2C12 細胞中通過Myogenin啟動子去甲基化，上調(diào)Myogenin表達，從而促進成肌細胞的分化。該研究揭示了產(chǎn)肉量差異豬種的胚胎期肌肉發(fā)育的調(diào)控機制：因為五指山豬成肌基因較長白豬早去甲基化（胚胎18～21 d，五指山豬成肌基因甲基化程度從70%下降到42%，長白豬成肌基因甲基化從70% 下降到56%），成肌基因早表達導致成肌細胞較長白豬早進入分化過程。由于成肌細胞沒有足夠時間進行增殖，導致胚胎期初級肌纖維和肌纖維總數(shù)較少，因此五指山豬出生后的產(chǎn)肉量也較少（圖5）[28-30]。

4 對于不同豬種胚胎期骨骼肌WGBS 研究的思考

作者所在團隊對于不同豬種胚胎期肌肉發(fā)育的WGBS 研究有2 個新的發(fā)現(xiàn)：一個是在所研究的胚胎18、21、28 d，長白豬基因總體的DNA 甲基化水平均高于五指山豬（在胚胎期18～28 d，長白豬DNA 甲基化范圍為72%～77%，五指山豬DNA 甲基化范圍為69%～73.5%）[28]。前人在豬與小鼠、二花臉與大白豬的DNA 甲基化比較研究中，發(fā)現(xiàn)物種、品種特異的DNA甲基化模式[31-32]。 因此，推測存在這一現(xiàn)象的原因是長白豬具有品種特異性甲基化模式。另一個發(fā)現(xiàn)是長白豬和五指山豬2 個豬種中DNA 甲基化水平并不總和基因表達相一致。DNA 甲基化已經(jīng)被證實在很多物種和細胞類型中影響基因表達[33-34]。本團隊的研究發(fā)現(xiàn)，只有在轉(zhuǎn)錄起始位點（±0.2 kb）附近，基因表達和DNA 甲基化呈負相關關系，而在基因區(qū)，基因表達和DNA 甲基化則呈正相關關系[28]。這一發(fā)現(xiàn)也與之前在人類和牛中的發(fā)現(xiàn)一致[35-36]。

在本團隊的研究中，五指山豬成肌基因DNA 甲基化降低并且上調(diào)表達的進程較長白豬早[28]，其中包含了重要的成肌細胞分化條件因子Myogenin，成肌細胞分化標志基因Myh1以及決定成肌命運分化的H3f3a[37]，而后者也是作者所在團隊的蛋白組學研究中五指山與長白豬胚胎骨骼肌表達差異最大的蛋白[38]。哺乳動物的發(fā)育伴隨著特異的從頭開始的甲基化或去甲基化事件，這些事件被認為有利于細胞分化進程[39]。之前的研究也發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育階段，保持干性的基因獲得甲基化，而組織分化特異的基因逐漸失去甲基化[2]。因此，本團隊研究進一步證實了成肌基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近較早的DNA 去甲基化，以及成肌基因基因區(qū)較早較高的甲基化可能會觸發(fā)五指山豬成肌基因早于長白豬表達，導致成肌分化進程較早開啟，這也與本團隊研究發(fā)現(xiàn)的五指山豬出現(xiàn)肌纖維分化較早的現(xiàn)象相符[38]。

除了骨骼肌，其他的組織器官在小型豬中均小于長白豬，它們的發(fā)育差異可能具有相似的調(diào)控機制，尤其是在DNA 甲基化層面。然而作為肉用型動物，關于不同品種豬之間差異的研究主要涉及肌肉的主要性狀差異[30,35,40]，其他組織則鮮見報道。兩品種豬的總?cè)焉锲诙际?14 d 左右，然而五指山豬卻較早出現(xiàn)初級肌纖維[38]。差異的基因表達模式是導致這一現(xiàn)象的最重要原因，加之DNA 甲基化在細胞命運決定和胚胎期基因表達起始過程中發(fā)揮關鍵作用[41]。因此，本團隊的研究通過WGBS 發(fā)現(xiàn)五指山豬具有較早的成肌基因去甲基化進程，體外實驗也進一步證實了成肌基因較早的去甲基化會導致成肌細胞較早分化[28]。而這個表觀遺傳介導的胚胎肌肉發(fā)育模式是否適用于其他組織的發(fā)育仍需進一步研究。

5 豬胚胎期肌肉發(fā)育的DNA 甲基化研究展望

豬的肌纖維總數(shù)在出生前就已經(jīng)決定，而無論是中國地方豬種還是西方瘦肉型豬種，它們的胚胎期均為114 d 左右，因此相似胚胎時期內(nèi)的肌肉發(fā)育進程的差異很可能導致了不同豬種出生后產(chǎn)肉量的差異。除了基因表達調(diào)控以外，表觀遺傳學也是決定生物性狀重要的調(diào)控機制。隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、全基因組甲基化等測序技術(shù)的發(fā)展，通過在胚胎早期肌肉發(fā)育階段探究不同豬種差異的DNA 甲基化模式，可以溯源并篩選出導致不同豬種胚胎期成肌關鍵基因差異表達模式背后的原因，例如作者所在團隊發(fā)現(xiàn)的DNA 去甲基化酶Tet1的差異表達。利用近年來不斷發(fā)展的基因編輯手段（如CRISPR-Cas9 技術(shù)），構(gòu)建可誘導基因表達的基因編輯豬品系（如Cre-loxP基因敲入豬），在懷孕母豬胚胎期控制候選基因（如Tet1）的表達時間，從而改變胚胎早期DNA 甲基化修飾模式和成肌關鍵基因的表達時間，將為提高中國地方豬種產(chǎn)肉量提供新的方向。