高夢錦,李 雪,李京京,邢 凱,齊曉龍,王相國,郭 勇,倪和民,盛熙暉
(北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京 102206)
畜禽良種是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎,也是提高生產(chǎn)水平和效率的關鍵。近幾十年,畜禽遺傳改良過分追求生長速度,導致肉質下降[1-2]。但隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和消費水平的提高,人們對肉品質的要求不斷提升。因此,家畜肉質性狀的改良和育種研究已成為畜牧科學研究的熱點之一。肉質是指與肉品外觀和適口性相關的特性,其主要影響因素可歸納為遺傳和環(huán)境2 個方面。研究人員可以利用組學技術挖掘肉質性狀的調控基因或蛋白,深入了解肉質性狀調控機理,為下一步開展肉質性狀改良奠定理論基礎。在肉質評定方面,常用的指標有pH 值、肉色、系水力、嫩度等。但是目前國內外對畜禽肉質評定標準還未完全統(tǒng)一,研究者對肉質指標的評定方法和條件各有不同,不同試驗結果之間的可比性較差,組學技術或可為解決此問題提供新思路。組學技術包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等,目前其已成為畜禽肉質性狀研究的有力工具,在畜禽肉質性狀及調控機理研究中應用廣泛。本文綜述了組學技術在畜禽肉質性狀研究中的應用現(xiàn)狀,并對其前景進行了展望。
基因組學旨在研究基因組的結構和功能,主要包括結構基因組學和功能基因組學2 個方面。2000 年,人類基因組計劃完成,隨后紅原雞、海福特牛、杜洛克豬等家畜也先后完成了基因組測序工作[3],為家畜育種研究提供了重要的基因組信息。目前,基因組學技術已廣泛應用在畜禽肉質性狀育種研究中,主要包括基因芯片和基因組重測序等。
1.1 基因芯片 基因芯片運用核酸互補雜交原理,在載體表面有規(guī)則地構建DNA“探針”陣列,探針將與同位素或熒光標記的樣品進行雜交,通過檢測雜交圖譜熒光信號強弱可測定樣品中目的基因的數(shù)量及組成[4]。在家養(yǎng)動物肉質研究中,Kaifan 等[5]比對了藍塘豬和大白豬的脂肪酸含量及其組成,并用微陣列技術和實時定量PCR 技術確定了影響其脂肪酸組成的候選基因。Hausman 等[6]運用Affymetrix 基因芯片對不同周齡科寶肉雞的腹部脂肪組織進行基因微陣列分析,共篩選出330 個差異表達基因,這些基因可作為腹部脂肪沉積調控研究的候選基因?;蛐酒c生物信息學的結合使研究人員從最初1 個月測序1 個或2 個基因到現(xiàn)在幾個小時即可研究數(shù)萬個基因,加快了肉質性狀研究中挖掘差異表達基因的進程,節(jié)約了大量的時間成本。
1.2 全基因組重測序技術 全基因組重測序技術是在已知物種基因序列的基礎上,通過比較該物種不同個體基因組之間的差異,運用各種生物信息學技術分析變異信息,進而研究其遺傳變異和分子標記。在家畜肉質性狀的研究中,Kong 等[7]以雞高/低肌肉顏色品系和隨機繁殖對照系為研究對象,利用Illumina 測序平臺對每個品系各10 只雞進行全基因組重測序挖掘雞肉中負責調節(jié)肌肉顏色的遺傳變異,共鑒定出數(shù)百萬個單核苷酸多態(tài)性,其中有15 個與肌肉顏色顯著相關。Li 等[8]利用全基因組重測序技術在全基因組范圍內比對西藏野豬、家豬和普通野豬的SNP 變異信息,研究發(fā)現(xiàn)在人工選擇下共有516 個候選基因與家豬的生長、肌肉發(fā)育、嗅覺和免疫反應等生物過程有關。毛衍偉等[9]運用全基因組重測序技術對高/低脂肪含量安格斯牛×湘中黃牛雜交牛的背最長肌進行分析,結果發(fā)現(xiàn)脂肪形成基因、能量代謝基因等基因的多態(tài)性變化是影響肉牛肌內脂肪沉積能力的關鍵。全基因組重測序技術是一次性獲得大量且具有高分辨率數(shù)據(jù)的最佳方法,能夠在全基因組水平上找到與肉質性狀相關的遺傳變異位點,與此同時,對所獲得大量數(shù)據(jù)的分析及處理尤為關鍵。
RNA 在遺傳信息從DNA 傳遞到蛋白質的過程中起到了承上啟下的作用,所以轉錄組學是功能基因組學的一個重要方面[10]。轉錄組學又稱為基因表達圖譜,可以通過基因芯片、轉錄組測序和基因表達序列分析等技術研究某一特定條件下細胞或組織基因表達情況,并利用生物信息學方法進行數(shù)據(jù)處理和分析。轉錄組學技術已廣泛用于肉質相關基因的調控研究。
2.1 轉錄組測序 皮下、肌間和肌內脂肪是影響肉質的重要因素之一。Jung 等[11]對豬肝臟組織進行轉錄組測序發(fā)現(xiàn),非同義單核苷酸變異可通過影響死后代謝相關基因表達的表觀遺傳調控進而影響多種肉質性狀。Piórkowska 等[12]對兩組剪切力存在顯著差異的哈伯德FLEX 系列肉雞的胸肌組織進行全轉錄組測序,初步篩選出了與雞胸肌肌肉轉化、脂肪生成和膠原合成有關的基因。為探索高濃度氨對肉雞肉質的影響,Yi 等[13]利用轉錄組測序技術比較了暴露于不同氨濃度下的愛拔益加肉雞胸肌的轉錄組,共鑒定出了267 個候選基因,這些基因都參與了脂質代謝過程。Billerey 等[14]采集了9頭利木贊公牛的背最長肌樣本,利用全轉錄組測序方法鑒定出超過500 種的lncRNA,這些lncRNA 可能有助于肉質性狀遺傳變異的相關研究。Sodhi 等[15]利用轉錄組測序技術研究了濟州島本地豬與巴克夏豬脂肪組織的差異表達基因,這些基因為進一步研究豬的脂肪沉積機制奠定了基礎。Li 等[16]利用轉錄組測序技術對白來航雞的骨骼肌進行研究,結果發(fā)現(xiàn)了新型lncRNA,結合RT-PCR 結果發(fā)現(xiàn)lncRNA gga-lnc-0181 在骨骼肌中高度表達。利用轉錄組測序可以有效獲得肉質性狀相關的基因編碼序列,因只研究被轉錄的基因,其相較于基因組學而言針對性更強。
2.2 小分子RNA 測序 生物體細胞內存在著大量的小分子RNA,包括小片段干涉RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、Piwi 蛋白相互作用RNAs(piRNAs)、核仁小RNA(snoRNA)和核內小RNA(snRNA),其作為生命活動重要的調控因子在轉錄后基因表達調控、生物體的生長發(fā)育、疾病、代謝及生殖等方面發(fā)揮著重要作用。microRNA 是一種內源性的非編碼小RNAs,轉錄后可調控基因表達。越來越多的證據(jù)表明,microRNA 在體外和體內脂肪生成過程中起著重要作用,并且對家畜肉品質有影響[17-20]。Zhang 等[21]以6 只固始母雞為研究對象,分別測定了3 只20 周齡雞(G20W 組)和3 只55 周齡產(chǎn)蛋后期母雞(G55W 組)右側胸肌的肌內脂肪含量,并提取了左側胸肌、肝臟、心臟、脾臟、肺、腎、十二指腸、卵巢和腹部脂肪組織的RNA 進行miRNA 測序,研究結果表明,與G20W組相比,G55W 組右側胸肌肌內脂肪含量較高,其總miRNA 表達水平低,2 組共鑒定出104 個差異表達miRNA。為更好地理解miRNA 在牛脂肪沉積中的差異表達和機制,Wang 等[22]通過微陣列分析了6 頭成年肉牛肌內脂肪和皮下脂肪的差異miRNA,研究發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-145、miR-26a、miR-2373-5p 和miR-23b-3p 在肌內脂肪中高表達,而miR-26a、miR-2373-5p、miR-2325c、miR-3613 和miR -2361 在皮下脂肪中豐度最高。目前,小分子RNA 測序技術在畜禽肉質方面的研究主要集中于miRNA,對于其他小分子RNA 還有待研究。
蛋白質組學于1994 年由澳大利亞麥考瑞大學的Wilkins 和Williams 提出,用來描述對特定蛋白質組的研究,它是在特定生理條件下和特定時間由生物系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質的整個復合體[23]。蛋白質是生命活動的體現(xiàn)者,因此蛋白質組學研究可以更有效地闡明生命過程的分子機制。在畜牧科學研究中,蛋白質組學是診斷畜禽疾病,生產(chǎn)優(yōu)質、安全的動物產(chǎn)品,提高動物生產(chǎn)效率的有力手段。通過蛋白質組學技術可以鑒定與肌肉品質指標相關的蛋白質,全面深入地研究肉質性狀的形成機制。目前,蛋白質組學相關技術主要包括如下3 種。
3.1 雙向凝膠電泳和質譜技術 雙向凝膠電泳作為最廣泛使用的蛋白質分離方法之一,其原理是蛋白質根據(jù)第一維度中的等電點和第二維度中的分子量通過兩次電泳將其分離[24]。質譜技術具有高靈敏度和準確性,極大地擴展了蛋白質組學的研究。在運用雙向凝膠電泳分離蛋白質之后,凝膠點可以被分開切除并進行隨后的蛋白質溶解消化。消化后產(chǎn)生的肽段混合物可利用質譜技術鑒定蛋白質或肽段。利用雙向電泳結合質譜技術,D'Alessandro 等[25]在牛肉中發(fā)現(xiàn)了3 個與嫩度相關的標記蛋白質。曹夢等[26]通過雙向電泳和質譜技術聯(lián)用分析白萊航、快大黃雞和北京油雞的肌肉組織蛋白表達差異,研究發(fā)現(xiàn)11 個蛋白表達差異點,其中3 種蛋白表達差異極顯著。趙珺[27]對3 只成年內蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌進行蛋白質組學分析,鑒定出了骨骼肌的3 種差異蛋白并建立了絨山羊骨骼肌差異蛋白譜。雙向凝膠電泳在畜禽蛋白質組學領域中的應用已較為成熟,隨著質譜靈敏度的提高,其已成為首選的分離方法。
3.2 同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術 iTRAQ技術作為一種新型蛋白質標記定量技術,可同時對4 個或8 個不同樣品進行蛋白定量比較,并且能對樣本中的幾乎所有蛋白質進行結合,標記過程更簡單,與質譜儀串聯(lián)檢測更靈敏[28]。相比于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳分析,iTRAQ 技術可以提供更可靠的定量測定和樣品比較[29]。Wang 等[30]以6 月齡藏豬、滇南小耳豬、約克夏豬和長白豬為研究對象,利用iTRAQ 技術初步篩選出了調控豬背最長肌脂肪代謝、沉積和肌肉生長的關鍵蛋白質。付睿琦[31]利用iTRAQ 技術獲得不同發(fā)育階段北京油雞的胸肌肌肉發(fā)育和脂肪代謝主要途徑和關鍵蛋白。王紅楊[32]以胚胎期至生長早期北京油雞和科寶肉雞為研究對象,利用iTRAQ 技術和生物信息學技術對雞胸肌組織蛋白表達情況進行分析獲得與肌肉發(fā)育和肌內脂肪沉積相關關鍵蛋白和通路。郝瑞杰[33]以雪龍黑牛、云嶺牛、秦川肉牛和傳統(tǒng)秦川牛為研究對象,利用iTRAQ 技術分析其背最長肌的蛋白質,結果共篩選到了6 個與脂肪細胞增殖和分化相關的蛋白質,初步推測了肌內脂肪沉積的可能調控機理。Bjarnadottir 等[34]利用iTRAQ 技術研究挪威紅公牛背最長肌低剪切力組與高剪切力組,發(fā)現(xiàn)了3 個與嫩度相關的蛋白質。目前,iTRAQ 技術與多維液相及色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用技術已在蛋白質組學中廣泛應用,其在獲取樣本中差異蛋白及挖掘生物標記物等方面具有優(yōu)勢。
代謝組學是蛋白質組學的進一步延伸,用于研究某一生物或細胞的代謝路徑底物和產(chǎn)物變化規(guī)律,尤其是小分子代謝物質,揭示生物生命活動代謝的本質[35]。由于代謝產(chǎn)物種類繁多并且不能像基因、蛋白質一樣根據(jù)堿基、氨基酸來測序,目前還未有一種可以同時分析所有代謝產(chǎn)物的方法,一般是根據(jù)代謝產(chǎn)物的類型和研究目的來選擇不同的分析方法,較為常見的分析方法有色譜、質譜、核磁共振、紫外吸收、放射性檢測及紅外光譜等[36-37]。現(xiàn)今,代謝組學已廣泛應用于植物、食品、醫(yī)藥及疾病診斷等領域,并取得了豐碩的成果。在畜禽肉質性狀研究中,目前對牛和豬的研究較多,并主要集中于代謝分子全基因組關聯(lián)分析研究(Genome-Wide Association Studies with Metaotypes,mGWAS),用于篩選影響肉質的遺傳標記或重要候選基因。例如,F(xiàn)ASN和SCD基因與牛背最長肌的中、長鏈脂肪酸含量顯著相關[38-39],ELOVL等重要候選基因與豬背最長肌中脂肪酸含量顯著相關[40]。
各種組學技術以及多組學聯(lián)合技術已廣泛應用于畜禽肉質性狀的研究領域,為全面深入地探索畜禽肉質性狀的調控機制提供了新思路?;蚪M學通過對畜禽重要經(jīng)濟性狀位點的研究可大幅度提高養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效益,目前標記輔助選擇等分子育種技術已經(jīng)運用于畜禽育種實踐中。轉錄組學可從RNA 水平上整體分析不同組織或生理狀況下所有基因的表達,分析轉錄組數(shù)據(jù)有助于得到新的功能基因和代謝通路,為畜禽育種提供新思路?;诘鞍踪|組學數(shù)據(jù)分析,可以建立蛋白質組學數(shù)據(jù)庫、挖掘低表達基因并比較樣本間表達差異蛋白。在育種過程中,利用蛋白質組學技術有助于確定動物經(jīng)濟性狀候選基因,從而加快育種進程。相較于其他組學技術,代謝組學尚處于新生階段,在檢測技術、數(shù)據(jù)分析等方面仍需進一步完善,但代謝組學在遺傳育種中已表現(xiàn)出巨大潛能,如通過mGWAS 篩選特定標記代謝分子。與此同時,各種組學技術的聯(lián)合使用對數(shù)據(jù)分析方法提出了新挑戰(zhàn)。未來,隨著組學技術的不斷發(fā)展和完善,這些技術將更廣泛地應用于畜禽肉質性狀的選育及其遺傳機制的闡明。