王志秀，張紅亮，王統(tǒng)苗，梁文雙，張 博，張 浩*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.西藏自治區(qū)拉薩市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，西藏拉薩 860000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

藏豬是我國(guó)獨(dú)特的高原型地方豬種，其長(zhǎng)期生活在海拔較高的青藏高原地區(qū)，能適應(yīng)低氧、低壓、高寒和強(qiáng)輻射環(huán)境，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良特性[1]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白3（sFRP3）由FRZB基因編碼，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Wnt/beta catenin 信號(hào)途徑參與胚胎發(fā)育調(diào)控[2]。FRZB是Wnt 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，過(guò)表達(dá)可以抑制前列腺癌PC-3 細(xì)胞的成瘤性和生長(zhǎng)性，并降低金屬蛋白酶的分泌和活性，具有抑癌基因的作用[3]。在對(duì)胃黏膜、大腸黏膜和腫瘤組織FRZB基因表達(dá)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)該基因具有腫瘤抑制的功能[4]。FRZB基因也可調(diào)控心臟房室膜墊發(fā)育，通過(guò)下調(diào)Wnt-9a 途徑介導(dǎo)的β-catenin 信號(hào)發(fā)揮作用[5]。FRZB基因與骨骼的形態(tài)發(fā)生有密切關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)FRZB基因和Wnt 受體基因的表達(dá)均與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)[6]。FRZB基因的突變位點(diǎn)與骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生等密切相關(guān)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)豬FRZB基因位于15 號(hào)染色體上，由6個(gè)外顯子組成，已鑒定出3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其表達(dá)與肌肉生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，與脂肪沉積呈正相關(guān)[8]。FRZB基因位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬背膘厚呈極顯著相關(guān)[9]，并對(duì)淮豬新品系的生長(zhǎng)性能具有顯著影響[10]。本研究旨在克隆藏豬FRZB基因CDS 序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體，為后期研究該基因的重要功能及其在細(xì)胞增殖、分化方面的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建FRZB轉(zhuǎn)基因豬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 藏豬飼養(yǎng)在西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場(chǎng)，6月齡時(shí)屠宰，采集新鮮肝臟組織，置于凍存管放入液氮罐中速凍，然后于-80℃冰箱保存，用于總RNA 提取。

1.2 主要試劑 TRIzol、2×PCR Mix、限制性內(nèi)切酶Bgl II 和 Sal I 均購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA 純化回收試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 連接酶購(gòu)自天根生化科技有限公司；DMEM、Opti-MEM、胰 酶、DMSO、胎 牛 血 清（FBS） 均 購(gòu) 自Gibco 公司；Lipofectamine 2000、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit Ⅰ）購(gòu)自Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T、pIRES2-EGFP 載體及C2C12 細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳資源實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 豬FRZB基因mRNA序列（登錄號(hào)：NM_001243330），利用Primer premier 5設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增FRZB基因的完整CDS 區(qū)序列。FRZB引物序列：F： 5'-GAAGATCTATTGTGTCCACTTCCA GGGGT-3'；R：5'-GCGTCGACGTTGCGTGCTTGCC GAGGGTTA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)1 067 bp，其中下劃線部分分別為Bgl II 和Sal I 酶切位點(diǎn)。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 RNA 提取和cDNA 合成 采用TRIzol 與RNApure Tissue Kit 提取肝臟組織總RNA，用NanoDrop?ND-1000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度。利用兩步反轉(zhuǎn)法合成cDNA，第一步：5×gDNA Buffer 2μL，Total RNA 7 μL，RNase-Free ddH2O 1μL，42℃孵育3 min；第二步：在第一步產(chǎn)物中依次加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，反應(yīng)程序?yàn)?2℃孵育15 min，95℃孵育3 min。

1.5 PCR 反應(yīng) 以cDNA為模板擴(kuò)增藏豬FRZB基因CDS 序列。PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。PCR 反 應(yīng) 程 序：95 ℃預(yù)變性15 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸65 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳，檢測(cè)產(chǎn)物條帶。

1.6 生物信息分析 對(duì)藏豬FRZB基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用ExPASy 相關(guān)在線服務(wù)器分析藏豬FRZB編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成、理論分子、親水性和等電點(diǎn)等；利用DNAMAN 軟件對(duì)預(yù)測(cè)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)；利用MEGA 6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用SWISSMODEL 預(yù)測(cè)FRZB 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 克隆與測(cè)序 將擴(kuò)增目的片段回收、純化，并TA 克隆至pMD18-T 載體上，連接體系10 μL：Solution 4 μL，pMD18-T 載體1 μL，擴(kuò)增目的片段5 μL。16℃恒溫過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在含有卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)。挑取單克隆，將其置于含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。重組質(zhì)粒命名為pMD18-TFRZB。

1.8 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bgl II 和Sal I 酶對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-FRZB和質(zhì)粒pIRES2-EGFP 進(jìn)行雙酶切，分別回收相應(yīng)片段的酶切產(chǎn)物。利用T4 DNA 連接酶將目的片段與pIRES2-EGFP 骨架載體進(jìn)行連接，連接體系10 μL：目的片段4 μL、骨架載體4 μL、T4 連接酶1 μL、10×Buffer 1 μL?；靹蚝笾糜?6℃孵育過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取單個(gè)菌落接種至含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，得到重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB，經(jīng)雙酶切鑒定和PCR 驗(yàn)證后，將鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C2C12 細(xì)胞進(jìn)行傳代至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80% 時(shí)，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFPFRZB經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到C2C12 細(xì)胞中，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。48 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1FRZB基因PCR 擴(kuò)增及序列分析 藏豬FRZB基因PCR 擴(kuò)增特異性條帶為1 067 bp（圖1），與預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度一致，且無(wú)非特異性擴(kuò)增雜帶。經(jīng)測(cè)序證明與豬FRZB基因序列高度一致。

2.2FRZB基因蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 藏豬FRZB蛋白質(zhì)含有325 個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為36.16 ku，分子式為C1580H2553N455O465S25，等電點(diǎn)為8.81，總平均親水性為-0.278，表現(xiàn)為親水性。藏豬FRZB 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)見圖2，發(fā)現(xiàn)含有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，有明顯的折疊層次，疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面。

藏豬FRZB 蛋白氨基酸序列與GenBank 中狗（XP_025316201.1）、小鼠（NP_035486.1）、綿羊（XP_011987 239.1）、黃牛（NP_776484.1）、馬（XP_001501445.1）和人（NP_001454.2）的同源性依次為91.13%、91.38%、94.46%、96.69%、97.23%和96.92%。由圖3 可知，F(xiàn)RZB基因在不同的動(dòng)物中具有較高的序列保守性。

2.3FRZB基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pMD18-T-FRZB和載體骨架pIRES2-EGFP 雙酶切，產(chǎn)物可見1 067 bp 和5 308 bp 的條帶（圖4），條帶清晰明亮，與預(yù)期結(jié)果一致。

切膠回收酶切產(chǎn)物載體骨架pIRES2-EGFP 和FRZB的目的條帶，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，挑單克隆擴(kuò)繁，對(duì)菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5 所示，目的條帶清晰，其大小約為1 067 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，表明pIRES2-EGFP-FRZB載體構(gòu)建成功。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pIRES2-EGFPFRZB真核表達(dá)載體。

重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB的Bgl II 和Sal I 雙酶切結(jié)果如圖6 所示，可見一條1 067 bp 條帶，與目的基因條帶大小一致；另一條約為5 308 bp，與載體骨架大小一致。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用Lipofectamine2000 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞，培育48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞有綠色熒光（圖7），表明pIRES2-EGFP-FRZB真核表達(dá)載體構(gòu)建成功且能轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞。

3 討 論

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖及凋亡中扮演重要角色，同時(shí)這一信號(hào)通路異常會(huì)伴隨動(dòng)物機(jī)體發(fā)育、生長(zhǎng)和穩(wěn)態(tài)的異常[11]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族（sFRPs）有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，與卷曲受體的細(xì)胞外配體結(jié)合域高度同源，因此，sFRPs可通過(guò)隔離Wnt 配體與卷曲受體形成非功能性復(fù)合物來(lái)抑制Wnt 信號(hào)通路[3]，這在胚胎發(fā)育和腫瘤形成等方面發(fā)揮著重要功能[12]。Qin 等[13]在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)敲除FRZB基因能增加細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，同時(shí)伴隨Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被激活，將進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的蔓延。馬玉玲等[14]對(duì)人FRZB基因進(jìn)行克隆，獲得了慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒，并研究其在肝癌細(xì)胞中的抗癌潛力，發(fā)現(xiàn)慢病毒表達(dá)體系對(duì)Wnt 信號(hào)通路的分子靶向藥物研究具有重要意義。司維柯[15]研究猜測(cè)FRZB 可能是一種天然抗腫瘤因子。瞿穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)FRZB與胃癌的分化和腸型及彌漫型的發(fā)生相關(guān)，并構(gòu)建FRZB真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系SGC-7901 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FRZB基因的高表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、成瘤性和侵襲能力[17]。這充分說(shuō)明FRZB基因在抑制腫瘤方面具有重要的意義。

目前，豬FRZB基因的研究報(bào)道相對(duì)較少，已鑒定出豬FRZB基因有3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其表達(dá)分別與肌肉生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)[10]、與脂肪沉積呈正相關(guān)[8]、與背膘厚呈極顯著相關(guān)性[9]。藏豬是少有的高原型豬種，生長(zhǎng)緩慢，適應(yīng)性極強(qiáng)，屬典型的地方品種，因具有胴體瘦肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、適口性極好等特點(diǎn)，屬奢侈品消費(fèi)行列，市場(chǎng)上供不應(yīng)求。本實(shí)驗(yàn)首次克隆藏豬FRZB基因并成功構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)FRZB基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FRZB基因在不同家畜物種及進(jìn)化過(guò)程中具有較高的序列保守性，提示FRZB基因潛在的分子功能應(yīng)用價(jià)值很大，尤其是研究耐低氧低壓、高寒強(qiáng)輻射的藏豬，對(duì)藏豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展和高原醫(yī)學(xué)的研發(fā)具有重要意義。盡管當(dāng)前FRZB基因調(diào)控豬生長(zhǎng)性能的分子機(jī)制尚不明確，但構(gòu)建藏豬FRZB基因的真核表達(dá)載體能夠?yàn)楹笃谘芯吭摶虻闹匾δ芗捌湓诩?xì)胞增殖、分化方面的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為探索豬肌細(xì)胞分化過(guò)程中特異基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和生產(chǎn)轉(zhuǎn)FRZB基因豬提供理論依據(jù)，對(duì)挖掘藏豬品種資源的利用具有巨大的開發(fā)指導(dǎo)價(jià)值。

4 結(jié) 論

豬FRZB基因在進(jìn)化過(guò)程中的保守性非常穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了藏豬FRZB真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-FRZB，并在C2C12 細(xì)胞中成功表達(dá)，為豬生長(zhǎng)性能調(diào)控機(jī)制方面的研究奠定了基礎(chǔ)。