譚光輝，張依裕，李杰章，覃媛鈺，吳 磊

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025）

蛋殼品質(zhì)的提高一直是家禽生產(chǎn)中亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題，高質(zhì)量蛋殼不僅能夠防止微生物的感染和機(jī)械破損，而且能夠提高孵化率并解決運(yùn)輸中破損等問題。鈣作為蛋殼不可或缺的營養(yǎng)因素，占蛋殼重量的40% 左右，鈣沉積與蛋殼質(zhì)量的好壞有直接聯(lián)系?？梢?，鈣在蛋殼形成的過程中非常重要。探究與Ca2+調(diào)控相關(guān)基因的多態(tài)性，進(jìn)而通過選擇培育來改善蛋殼品質(zhì)是一個(gè)有效的途徑。蛋白激酶Cα（Protein kinase C-alpha,PRKCA）是一類絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶，可被鈣和第二信使二?；视图せ?，屬于蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）家族成員之一，其家族成員磷酸化多種蛋白靶點(diǎn)，參與多種信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，包括鈣離子信號(hào)通路調(diào)控[1-4]。近年來，眾多關(guān)于人PRKCA基因生物功能的研究表明，PRKCA基因控制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，與腫瘤增殖、侵襲、藥物抵抗性密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。另外，蛋白激酶Cα在上皮組織中起著重要的作用，并且能夠通過對(duì)Ca2+進(jìn)行調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞的存活與增殖[7-8]。相反，在三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞中，Ca2+能夠介導(dǎo)PRKCA的活化來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞的遷移[9-10]。因此，PRKCA基因與Ca2+能夠通過相互調(diào)節(jié)來調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡。此外，PRKCA基因在動(dòng)物機(jī)體中也發(fā)揮重要作用，Pan 等[11]研究顯示骨骼PRKCA基因表達(dá)增加可促進(jìn)雞骨骼鈣素的沉積；Monteverde 等[12]研究發(fā)現(xiàn)利用小鼠胚胎成纖細(xì)胞（mef）致癌轉(zhuǎn)化時(shí)，Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)能促進(jìn)PRKCA海拉細(xì)胞的激活。當(dāng)小鼠PRKCA基因敲除后，心肌細(xì)胞收縮能力發(fā)生改變，進(jìn)一步研究揭示PRKCA基因可能是心肌細(xì)胞收縮力和Ca2+處理的基本調(diào)控因子[13]。綜合前人研究可見，PRKCA基因在Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中有重要作用，因此PRKCA基因可能調(diào)控鴨蛋殼腺部位Ca2+的釋放或調(diào)控相關(guān)組織細(xì)胞的增殖與凋亡，對(duì)蛋殼品質(zhì)產(chǎn)生影響，但迄今為止，有關(guān)PRKCA基因在鴨上的生物功能研究尚未見相關(guān)報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以櫻桃谷鴨為研究素材，檢測(cè)PRKCA基因的遺傳變異，探討基因變異對(duì)鴨蛋殼品質(zhì)的影響，旨在為提高鴨蛋殼品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院家禽研究所隨機(jī)選擇同一天孵化、健康無病櫻桃谷鴨200 只，在相同的自由放養(yǎng)的環(huán)境長大，直到10 周齡時(shí)進(jìn)行單體籠飼養(yǎng)，并且每只鴨靜脈采血1～1.5 mL 用于鴨基因組DNA的提取。在45 周齡時(shí)，每只母鴨連續(xù)7 d 收集鴨蛋以測(cè)定蛋殼質(zhì)量。鴨蛋重、蛋殼重、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度在收集雞蛋后12 h 內(nèi)測(cè)量。

1.2 蛋殼品質(zhì)的測(cè)量 蛋重和蛋殼重：洗凈鴨蛋上鴨糞等污染物后用電子天平（型號(hào)為BL-320H，購自日本島津公司）稱量；去除蛋黃和里面殘留蛋液稱量蛋殼重量。

蛋形指數(shù)：游標(biāo)卡尺（購自武漢道簡(jiǎn)貿(mào)易有限公司）測(cè)量鴨蛋的長徑和短徑，精確到0.1 mm，蛋形指數(shù)等于長徑/短徑。

蛋殼厚度：蛋殼厚度測(cè)定儀（型號(hào)ETG-1061，購自北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司）分別測(cè)定銳端、鈍端和側(cè)面的蛋殼厚度，取3 個(gè)值的平均數(shù)得到蛋殼厚度，精確度0.01 mm。

蛋殼強(qiáng)度：蛋殼強(qiáng)度是蛋殼致密堅(jiān)固性指標(biāo)，指對(duì)蛋碰撞和擠壓的承受能力。用蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀（型號(hào)為EFR-01，購自北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司）測(cè)定，單位為N/cm2。

1.3 血液基因DNA 的提取、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)血液DNA提取試劑盒（購于天根生化科技有限公司）抽提血液中基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，并用Nanodrop 2000 檢測(cè)提取DNA 的純度和濃度，最終稀釋成濃度100 ng/μL 備用。在Genbank數(shù)據(jù)庫調(diào)取鴨PRKCA基因組外顯子序列（登錄號(hào)：NC_040064.1）運(yùn)用在線版 Primer 3.0（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物見表1，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增程序 反應(yīng)體系：PCR Master Mix 10.0 μL，RNase-Free Water 7.5 μL，10 pmol/L 正、反向引物各1.0 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性6 min；94℃變性30 s，退火（溫度見表1）50 s，72℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。以個(gè)體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，檢測(cè)有目的條帶的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)序結(jié)果采用DNA Star 軟件中MegAlign程序篩查鑒定SNP 位點(diǎn)，運(yùn)用SHEsis 網(wǎng)上在線軟件（http://analysis.bio-x.cn/）計(jì)算SNP 位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值（χ2）、連鎖不平衡的D'值和γ2值、觀察雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）；采用SPSS18.0 軟件中的一般線性模型（GLM）分析SNP 位點(diǎn)基因型或雙倍型與所測(cè)定性狀指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1PRKCA基因PCR 擴(kuò)增 如圖1 顯示，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增所獲得的目的片段呈現(xiàn)單一、明亮的條帶，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)設(shè)片段大小相符，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

表1 鴨PRKCA 基因的引物信息

2.2 櫻桃谷鴨PRKCA基因SNPs 篩查與鑒定 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，利用DNAStar 軟件和MegAlign 程序分析測(cè)序結(jié)果，將PRKCA基因原始序列和全部櫻桃谷鴨引物擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì)，查找單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，結(jié)果見圖2，共發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNP 變異位點(diǎn)：分別是g.9583222C＞T 和g.9583228G＞A，都位于PRKCA基因第7 外顯子，分別位于基因CDS 區(qū)第723 位和729 位，2 個(gè)突變位點(diǎn)均產(chǎn)生3 種基因型。

2.3 櫻桃谷鴨PRKCA基因2 個(gè)SNPs 的遺傳特性分析 對(duì)2 個(gè)SNP 進(jìn)行遺傳特性分析，結(jié)果見表2，g.9583222C＞T 和g.9583228G＞A 2 個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型分別為CC 和GG，頻率分別為0.510 和0.385；優(yōu)勢(shì)等位基因分別是C 和G，頻率分別是0.675 和0.563；2 個(gè)SNP 位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），經(jīng)χ2檢驗(yàn)2 個(gè)SNP 位點(diǎn)的等位基因都極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.01）。

2.4 SNPs 連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析 對(duì)櫻桃谷鴨檢測(cè)的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)g.9583222 C＞T 和g.9583228 G＞A 進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果2 個(gè)SNP 位點(diǎn)之間的D'值等于1，大于0.800；γ2值等于0.385，大于0.330。根 據(jù)Ardlie 等[14]和Slatkin[15]的 報(bào) 道，當(dāng)|D'|＞0.8 和γ2＞0.33 時(shí)認(rèn)為SNPs 位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡。揭示了本研究發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡。

表2 櫻桃谷鴨PRKCA 基因SNP 位點(diǎn)群體遺傳參數(shù)

對(duì)2 個(gè)SNP 進(jìn)行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果見表3。2 個(gè)SNP 位點(diǎn)在櫻桃谷鴨群體中共檢測(cè)到3 種單倍型和6 種雙倍型，單倍型H1 的頻率（0.513）最高，為優(yōu)勢(shì)單倍型；H3 的頻率（0.163）為劣勢(shì)單倍型；雙倍型H1H1 頻率（0.335）最高，為優(yōu)勢(shì)雙倍型，H3H3 的頻率（0.050）最低，為劣勢(shì)雙倍型。

表3 櫻桃谷鴨PRKCA 基因2 個(gè)SNP 位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析

2.5 櫻桃谷鴨PRKCA基因2 個(gè)SNPs 與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析 如表4 所示，g.9583222 C＞T 突變位點(diǎn)與蛋殼強(qiáng)度有顯著相關(guān)性，CT 基因型個(gè)體蛋殼強(qiáng)度顯著高于TT 型，其他基因型無顯著差異；g.9583228G＞A 位點(diǎn)對(duì)櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標(biāo)的影響未能達(dá)到顯著水平。

2.6 SNPs 雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析如表5 所示，雙倍型H1H3 和H2H2 個(gè)體蛋重顯著高于H3H3；H2H3、H3H3 雙倍型個(gè)體蛋殼厚度顯著高于H2H2；H3H3 蛋殼強(qiáng)度顯著高于H2H2。其他雙倍型與蛋殼品質(zhì)沒有產(chǎn)生顯著差異。

3 討 論

蛋殼質(zhì)量是影響禽蛋生產(chǎn)效益的重要因素之一，尤其在大型養(yǎng)殖場(chǎng)，蛋殼品質(zhì)極為重要。標(biāo)記輔助選育是一種有效而簡(jiǎn)便的可行辦法，找到性狀基因座相關(guān)聯(lián)的分子遺傳標(biāo)記，則是實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的重要途徑。Haug 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRKCA基因需要甘油二酯（DAG）和磷脂酰絲氨酸（PS）和Ca2+輔因子的激活。PRKCA還能通過促進(jìn)白三烯D4 升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度從而激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[17]。另外，PRKCA 激活劑在不同Ca2+下增加了滲透性動(dòng)脈的收縮程度，而動(dòng)脈收縮需要通過依賴性Ca2+流入，證明PRKCA誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈收縮與Ca2+的降低有關(guān)[18]。目前，關(guān)于PRKCA基因遺傳變異對(duì)于鴨生產(chǎn)性能的效應(yīng)研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)櫻桃谷鴨PRKCA基因外顯子1、外顯子4 和外顯子7 進(jìn)行SNP 位點(diǎn)檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)同義突變位點(diǎn)，2 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡。Hardy-Weinberg 平衡定律是一個(gè)基本的群體遺傳學(xué)原理，該定律建立在許多假設(shè)的基礎(chǔ)上，包括隨機(jī)交配的有性繁殖、世代不重疊、可忽略的突變和遷移率、兩性等位基因頻率的平等、缺乏自然選擇，同時(shí)，在任何有限的群體中，基因在配子中的隨機(jī)分離和在合子里的隨機(jī)重組都會(huì)導(dǎo)致一定的誤差，引起基因頻率的變化[19]。因此，從本研究結(jié)果來看，2 個(gè)SNP 基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡，可能受到突變、選擇、遺傳漂變等影響，或者與本實(shí)驗(yàn)櫻桃谷鴨群體數(shù)量較少有關(guān)。

表4 櫻桃谷鴨PRKCA 基因SNP 位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

表5 PRKCA 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析

動(dòng)物體基因組功能結(jié)構(gòu)基因突變對(duì)其生產(chǎn)性能具有影響作用，其突變位點(diǎn)的連鎖關(guān)系決定群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)2 個(gè)SNP 進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)SNP 間不存在強(qiáng)連鎖不平衡，發(fā)現(xiàn)3 種單倍型和6種雙倍型。理論上應(yīng)該有4 種單倍型、9 種雙倍型，實(shí)際觀測(cè)值與理論值之間存在差異，可能是由于人工的長期選育導(dǎo)致單倍型（CG）和雙倍型TTGA、TTGG 和CTGG 個(gè)體被淘汰或者根本不存在該單倍型組合。本研究中，g.9583222C＞T 位點(diǎn)CT 基因型蛋殼強(qiáng)度顯著高于TT 基因型，該突變位點(diǎn)可以作為篩選較高蛋殼強(qiáng)度的分子標(biāo)記。這種突變可能與PRKCA基因的功能等位基因有關(guān)，影響鴨子宮內(nèi)Ca2+的沉積。2 個(gè)SNP 位點(diǎn)構(gòu)建的雙倍型對(duì)蛋重、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度有顯著影響。雙倍型H3H3 有利于提高蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度。蛋殼強(qiáng)度是蛋殼破損率最直接的體現(xiàn)，高強(qiáng)度蛋殼有利于降低蛋的破損，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，因此H3H3 是提高蛋殼品質(zhì)有利的雙倍型?？梢? 個(gè)SNP 組合基因型對(duì)蛋殼品質(zhì)的影響效應(yīng)明顯大于單個(gè)SNP 的影響。前人研究表明，同義突變雖然不會(huì)造成對(duì)應(yīng)氨基酸的改變，但可能會(huì)反復(fù)改變調(diào)控剪接的外顯子基序，如果這些突變位點(diǎn)與剪接位點(diǎn)相鄰可能導(dǎo)致剪接位點(diǎn)失活[20]，而且單核苷酸的替換會(huì)改變mRNA 的剪切效率或準(zhǔn)確性，對(duì)蛋白質(zhì)的功能、構(gòu)象和表達(dá)水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體鈣離子釋放，影響鈣蛋殼的形成過程[21-23]。由此推測(cè)，本研究檢測(cè)到的2 個(gè)SNP 共同聯(lián)合引起基因結(jié)構(gòu)變化強(qiáng)于單個(gè)SNP 對(duì)基因結(jié)構(gòu)變化的影響，其對(duì)蛋殼品質(zhì)的調(diào)控作用可能更有效。但在雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析中，雙倍型H3H3 個(gè)體數(shù)還是相對(duì)較少，因此，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果還需要進(jìn)一步增加測(cè)試樣本，進(jìn)一步確定本研究的結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，鴨PRKCA基因在所研究群體中存在一定的遺傳多樣性，在其外顯子7 發(fā)現(xiàn)2 個(gè)突變位點(diǎn)g.9583228 G ＞ A 和g.9583222 C ＞ T。關(guān)聯(lián)性分析表明，單個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.9583222C＞T）與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)有顯著相關(guān)性，其中CT 基因型能顯著提高蛋殼強(qiáng)度。2 個(gè)SNP 位點(diǎn)組合基因型與蛋殼品質(zhì)有顯著相關(guān)性，組合基因型CCAA 認(rèn)為是提高蛋殼品質(zhì)有利的組合基因型。