周桂旭,文陽宣,李新鋒,石亞偉

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

蛋白酶是一類肽鍵水解酶,在工業(yè)用酶中占有很大比例,按照反應(yīng)時最適pH分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶[1-2]。堿性蛋白酶和另外兩種蛋白酶相比,具有堿性條件下酶活力不受影響,以及溫度耐受范圍較廣等優(yōu)點,是全世界工業(yè)生產(chǎn)中用量最大的酶制劑之一[3]。堿性蛋白酶存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉果實以及微生物中,被廣泛應(yīng)用于紡織、皮革、醫(yī)藥、洗滌、食品等行業(yè)[4-5]。工業(yè)上使用的堿性蛋白酶主要為微生物來源的蛋白酶[6-7]。

在提高堿性蛋白酶活性、穩(wěn)定性等方面,既有利用野生菌株的篩選、菌株誘變等經(jīng)典方法,也有利用基因工程和蛋白質(zhì)工程定向改造的手段,但最終都離不開的利用菌體發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶這一環(huán)節(jié)。吳海波[8]等以低溫豆粕為培養(yǎng)基的主要成分,通過響應(yīng)面法對枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,堿性蛋白酶活性比未優(yōu)化前提高了37%;Rekik[9]等通過單因素實驗對BacillussafensisRH12的培養(yǎng)基進行優(yōu)化,優(yōu)化后堿性蛋白酶活力從450 U/mL提高到9 000 U/mL,酶活力大幅度提高;王麗麗[10]等用響應(yīng)面法對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件進行快速優(yōu)化,比初始酶活提高了33.19%。尹萌萌[11]等通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件使短小芽孢桿菌SCU11蛋白酶產(chǎn)量提高了1倍。

微生物產(chǎn)胞外酶很大程度上受發(fā)酵條件的影響,本實驗室前期構(gòu)建了含有堿性蛋白酶基因AP的重組質(zhì)粒pBE2R-AP,該質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600成功表達。本文對重組堿性蛋白酶工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵條件進行研究,為后續(xù)利用農(nóng)副產(chǎn)品作為培養(yǎng)基的綜合利用提供借鑒。

1 材料

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌WB600,重組質(zhì)粒pBE2R-AP均為實驗室保存;卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白胨、酵母提取物均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;糊精、氯化錳均為天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;無水氯化鈣、氯化鈉、硫酸鎂、氯化銅、三氯乙酸為天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司;可溶性淀粉、福林酚為國藥集團化學(xué)試劑有限公司;花生餅粉、豆粕、玉米粉等均為農(nóng)副產(chǎn)品,購自鑫旺達生物科技公司。

1.2 儀器

pH計(Starter 3C 奧豪斯儀器(上海)有限公司制造);HZ-8212S恒溫振蕩水浴(華利達科技器材廠);ZQZY-AF8振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司);ZHWY-100D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城制造有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

牛奶平板培養(yǎng)基:蛋白胨 1%,NaCl 1%,酵母提取物0.5%,瓊脂粉1.5%,牛奶2%,pH 7.0;LB種子培養(yǎng)基:蛋白胨1%,NaCl 1%,酵母提取物0.5%,pH 7.0;1號發(fā)酵培養(yǎng)基[12]:可溶性淀粉1.2%,酵母提取物0.3%,NaCl 1%,CaCl21 mmol/L,pH 7.0;2號發(fā)酵培養(yǎng)基[12]:可溶性淀粉2.5%,蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH 7.0;3號發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH 7.0;4號發(fā)酵培養(yǎng)基[13]:酵母提取物2%,蔗糖1%,吐溫80 0.5%,MgSO40.02%,pH 7.0;5號發(fā)酵培養(yǎng)基[10]:糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH 7.0。培養(yǎng)基配方百分濃度均為質(zhì)量百分數(shù)。

2 方法

2.1 菌株培養(yǎng)

Spizizen低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法[14-15]將質(zhì)粒pBE2R-AP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞中,涂布在含有40 μg/mL卡那霉素抗性的牛奶平板上,37℃,培養(yǎng)12 h。將牛奶平板上形成透明圈、生長正常的單菌落接至裝有100 mL LB種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37℃,200 r/min培養(yǎng)8 h。以4%的接種量將LB種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為16%的250 mL三角瓶中,37℃,200 r/min培養(yǎng)[16-17]。

2.2 堿性蛋白酶活力的測定

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min,取上清液測堿性蛋白酶活。堿性蛋白酶活力測定參照輕工業(yè)部頒標準QB/T 1803-1993(Folin試劑顯色法[18]),1個酶活力單位定義為:每分鐘每毫升酶液在溫度40℃,pH為10.5,水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所消耗的酶量。

2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

取1-5號發(fā)酵培養(yǎng)基,在37℃,200 r/min條件下進行培養(yǎng),每隔一段時間取上清液測定堿性蛋白酶活力,繪制1-5號培養(yǎng)基的產(chǎn)酶曲線,根據(jù)堿性蛋白酶活力確定基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 不同裝液量對產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,250 mL三角瓶中裝液量分別為8%、12%、20%、28%、36%、44%(V/V),37℃,200 r/min發(fā)酵60 h,取上清液測定酶活力,確定最佳裝液量。

2.4.2 不同接種量對產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%(V/V),37℃,200 r/min發(fā)酵60 h,取上清液測定酶活力,確定最佳接種量。

2.4.3 不同初始pH值對產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

將初始pH值分別調(diào)至為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,37℃,200 r/min發(fā)酵60 h,取上清液測定堿性蛋白酶活力,確定培養(yǎng)基最適初始pH。

2.5 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.5.1 不同碳源對產(chǎn)堿性蛋白酶影響

分別用3%的甘油、乳糖、糊精、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,pH 7.0,37℃,200 r/min條件下發(fā)酵60 h后,取上清液測定堿性蛋白酶活力,考察不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。

2.5.2 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

分別用4%的玉米粉、花生餅粉、麩皮、米糠、豆粕、大豆粉、芝麻餅粉、菜籽粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源,碳源為4%糊精,pH 7.0,37℃,200 r/min條件下發(fā)酵60 h后,取上清液測定堿性蛋白酶活力,考察不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。

2.5.3 金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

在含有4%糊精、4%花生餅粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度0.04%的CaCl2、MgSO4、MnCl2、CuCl2,pH 7.0,37℃,200 r/min發(fā)酵60 h,取上清液測定堿性蛋白酶活力,考察不同金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。

2.5.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,利用正交試驗方法,選取糊精、花生餅粉、酵母提取物、MgSO4等四個因素,堿性蛋白酶活力為考察指標,按照表1進行試驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

將重組枯草芽孢桿菌工程菌WB600/pBE2R-AP分別接種到1-5號發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃、200 r/min進行培養(yǎng),發(fā)酵終了測定堿性蛋白酶活力。結(jié)果如圖1所示,使用5種培養(yǎng)基培養(yǎng),達到堿性蛋白酶活最高時所需的時間不同,1號、2號、4號培養(yǎng)基在72 h時酶活力達到最高,3號、5號培養(yǎng)基在60 h時酶活力達到最高,其中5號培養(yǎng)基在60 h時酶活力最高達到258 U/mL,所以選取5號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

表1 正交試驗因素水平表

圖1 不同培養(yǎng)基對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

3.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.2.1 裝液量的確定

培養(yǎng)基為5號發(fā)酵培養(yǎng)基,在37℃,200 r/min培養(yǎng)條件下,研究三角瓶的不同裝液量對重組枯草芽孢桿菌工程菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖2所示,裝液量為8%時,堿性蛋白酶活力398 U/mL,裝液量為12%時酶活力最高412 U/mL；當裝液量增加到20%以上,酶活力均低于200 U/mL。

圖2 不同裝液量對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

3.2.2 接種量的確定

培養(yǎng)基為5號發(fā)酵培養(yǎng)基,裝液量12%,在37℃,200 r/min培養(yǎng)條件下,研究接種量對重組枯草芽孢桿菌工程菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖3所示,當接種量低于4%時,堿性蛋白酶活力隨著接種量增加而增加,接種量為4%酶活力最高達到505 U/mL；接種量大于4%時,堿性蛋白酶活力隨著接種量增加而降低。

圖3 不同接種量對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)蛋白酶的影響

3.2.3 培養(yǎng)基初始pH值的確定

培養(yǎng)基為5號發(fā)酵培養(yǎng)基,裝液量12%,接種量4%,在37℃,200 r/min培養(yǎng)條件下,研究基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值對重組枯草芽孢桿菌工程菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖4所示:在培養(yǎng)基初始pH 7.0時,酶活力最高446 U/mL；初始pH值偏高或者偏低都會導(dǎo)致發(fā)酵過程中的酶活力降低,選取初始pH 7.0進行后續(xù)實驗。

圖4 不同初始pH對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)蛋白酶的影響

圖5 不同碳源對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)蛋白酶的影響

3.3 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

3.3.1 不同碳源對產(chǎn)蛋白酶的影響

以5號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ),將碳源分別替換為3%的甘油、乳糖、糊精、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉,比較不同碳源對重組枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖5所示,以甘油作為碳源時堿性蛋白酶活力僅為21 U/mL。葡萄糖、可溶性淀粉和糊精作為碳源時堿性蛋白酶活力分別為424 U/mL、438 U/mL、468 U/mL,均能使酶活增加,其中糊精作為碳源時酶活力最高,選取糊精作為最佳發(fā)酵碳源。

3.3.2 不同濃度糊精對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

以5號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ),分別以濃度為2%、4%、6%、8%、10%的糊精作為碳源,比較不同濃度的糊精對重組枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶活性的影響。結(jié)果如圖6所示,糊精濃度為4%,產(chǎn)酶能力最佳,酶活力達到598 U/mL；但當糊精濃度超過4%時,酶活力逐漸降低,因此糊精濃度為4%效果最好。

圖6 不同濃度的糊精對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

3.3.3 不同氮源對產(chǎn)蛋白酶的影響

以5號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ),以4%的糊精作為碳源,比較濃度均為4%的玉米粉、花生餅粉、麩皮、米糠、豆粕、大豆粉、芝麻餅粉、菜籽粉等8種不同的有機氮源對枯草芽孢桿菌工程菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖7所示，8種有機氮源均可以顯著提高堿性蛋白酶的活力,其中花生餅粉為最佳發(fā)酵氮源,酶活力可達1 812 U/mL。

圖7 不同氮源對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

3.3.4 不同濃度的花生餅粉對產(chǎn)蛋白酶的影響

以5號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ),碳源為4%糊精,分別以濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的花生餅粉作為氮源,比較不同濃度的花生餅粉對重組枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶活性的影響。結(jié)果如圖8所示,花生餅粉濃度低于4%時,隨著花生餅粉濃度增加,堿性蛋白酶活力也在增加,當花生餅粉濃度為4%時,酶活力最高達到1 862 U/mL；而濃度高于4%時,堿性蛋白酶活力逐漸降低。確定花生餅粉的最適添加量為4%。

圖8 不同濃度的花生餅粉對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

圖9 不同離子對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

3.3.5 金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

在培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.04%的CaCl2、MgSO4、MnCl2、CuCl2,研究Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+4種金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶活性的影響。結(jié)果如圖9所示,培養(yǎng)基中添加CaCl2、CuCl2其堿性蛋白酶活力僅為638 U/mL、12 U/mL,添加MgSO4酶活力為1 835 U/mL,添加MnCl2酶活力為1 993 U/mL,相對于未添加金屬離子的培養(yǎng)基酶活力1 800 U/mL,Mg2+、Mn2+對酶活提高均有促進作用,考慮Mn是重金屬,選取Mg2+開展后續(xù)實驗。

3.3.6 MgSO4濃度對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.04%、0.12%、0.20%、0.28%、0.36%的MgSO4,研究不同濃度的MgSO4對重組枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。結(jié)果如圖10所示,當MgSO4濃度為0.20%時,堿性蛋白酶活力達到2 100 U/mL。

圖10 不同濃度的MgSO4對重組工程菌枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

3.3.7 正交實驗

結(jié)合單因素實驗結(jié)果,選取糊精、花生餅粉、酵母提取物和MgSO4等四個因素,設(shè)計正交試驗,優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。實驗設(shè)計與結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表2中由極差R分析得出,各個因素對產(chǎn)堿性蛋白酶的影響順序:B>C>A>D,即花生餅粉對產(chǎn)堿性蛋白酶的影響最大,其次影響產(chǎn)堿性蛋白酶的因素分別為酵母提取物、糊精、MgSO4。方差分析結(jié)果(表3)表明：花生餅粉對重組芽孢桿菌工程菌產(chǎn)堿性蛋白酶影響極顯著(P<0.01),酵母提取物對重組芽孢桿菌工程菌產(chǎn)堿性蛋白酶影響顯著(0.010.05)。這四個因素最佳組合為A3B1C1D3,即糊精5%、花生餅粉3%、酵母提取物1%、MgSO40.28%。結(jié)合單因素優(yōu)化的培養(yǎng)條件為起始pH 7.0,裝液量12%,接種量4%,在此條件下進行驗證試驗,重組芽孢桿菌工程菌在37℃,200 r/min培養(yǎng)60 h,堿性蛋白酶活力可達到2 605.91 U/mL。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析表

4 討論

每種微生物生長和酶的合成都有自身特殊的營養(yǎng)和環(huán)境要求,尋找微生物利于分解利用的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長條件,有助于激發(fā)微生物生產(chǎn)潛力。酶制劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源和氮源的選擇需要考慮誘導(dǎo)與代謝阻遏的影響,對于許多誘導(dǎo)酶來說,一些難被利用的碳源(如淀粉、糊精等)往往對產(chǎn)酶有利,特別是在酶制劑生產(chǎn)中幾乎都選用淀粉類原料作為碳源;在蛋白酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中除了考慮碳源外,還要在氮源上進行篩選,有機氮源富含蛋白質(zhì)和多肽利于蛋白酶的生產(chǎn)[19]。我們的實驗結(jié)果也表明：枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶所使用的培養(yǎng)基的糊精和花生餅粉對工程菌產(chǎn)蛋白酶效果最佳。

培養(yǎng)基成分的確定和優(yōu)化一直是菌體發(fā)酵生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié),為減少試驗次數(shù),常需要采用合理的實驗設(shè)計方法,如正交試驗、響應(yīng)面試驗設(shè)計等。Walaa A[20]通過響應(yīng)面CCD試驗設(shè)計,宋明徽[21]等通過正交試驗設(shè)計分別對不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化,都大大提高了堿性蛋白酶產(chǎn)量。本文以重組枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP為發(fā)酵菌株,以堿性蛋白酶的酶活力為考察指標,通過單因素實驗及正交設(shè)計得到實驗室搖瓶條件下的最佳產(chǎn)堿性蛋白酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:糊精5%,花生餅粉3%,酵母提取物1%、MgSO40.28%,接種量4%、裝液量12%,初始pH 7.0,此條件下37℃,200 rpm培養(yǎng)60 h,相對于初始培養(yǎng)基,堿性蛋白酶活力提高了10倍。優(yōu)化后培養(yǎng)基成分簡單、易獲得且成本低,為菌株發(fā)酵擴大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。