嚴(yán) 磊, 毛秀海, 左小磊

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究院, 上海市核酸化學(xué)與納米醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200127)

生物膜是細(xì)胞膜及各種細(xì)胞器膜的統(tǒng)稱, 由脂類(如磷脂和膽固醇等)、蛋白質(zhì)及多糖等生物物質(zhì)自組裝形成[1～3]. 近年來, 為了進(jìn)一步理解生物膜系統(tǒng), 研究者致力于構(gòu)建與其組分、結(jié)構(gòu)或功能相似的仿生膜體系. 同時, 作為一種新型的多功能復(fù)合材料, 仿生膜在智能醫(yī)用材料制備、疫苗開發(fā)、疾病診斷以及分子機(jī)器等領(lǐng)域也受到廣泛關(guān)注. 其中, 設(shè)計(jì)并構(gòu)建仿生功能膜蛋白是仿生膜研究領(lǐng)域中的重要環(huán)節(jié), 是決定仿生膜材料的性能及應(yīng)用范圍的關(guān)鍵因素[4]. 迄今, 科研人員已經(jīng)開發(fā)了一系列典型的仿生功能膜蛋白材料, 包括功能性互鎖分子、復(fù)合共軛聚合物、核酸樹狀分子、生物仿生多肽和核酸納米結(jié)構(gòu)等[5,6]. 其中, 使用框架核酸來構(gòu)建仿生功能膜蛋白是仿生膜研究領(lǐng)域中的重要方向. 框架核酸(Framework nucleic acids)是利用Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則設(shè)計(jì)并合成的三維立體的具有特定形狀與功能的核酸納米結(jié)構(gòu)(Nucleic acids nanostructure)[7～9]. 框架核酸具有納米級構(gòu)建精度及良好的可編程性等優(yōu)勢, 由其構(gòu)建的仿生功能膜蛋白能夠克服其它經(jīng)典納米結(jié)構(gòu)的尺寸、形狀及操控限制, 從而實(shí)現(xiàn)仿生膜的形狀或結(jié)構(gòu)控制、調(diào)節(jié)仿生膜內(nèi)外的分子通過與信息交流、靶向遞送與釋放納米藥物、檢測體內(nèi)及體外的化學(xué)物質(zhì)變化等, 為生物分析、疾病診斷和癌癥治療等領(lǐng)域的研究提供了新視角[10]. 本文基于框架核酸在仿生膜領(lǐng)域的研究價值及應(yīng)用前景, 簡要介紹了框架核酸的設(shè)計(jì)、組裝及表征方法, 隨后概括了基于框架核酸的仿生膜構(gòu)建方法及機(jī)制, 最后評述了基于框架核酸的仿生膜的應(yīng)用情況, 并對基于框架核酸的仿生膜材料進(jìn)行了總結(jié)與展望.

1 框架核酸的構(gòu)建與表征

1.1 框架核酸的構(gòu)建

框架核酸作為近年來新興的前沿交叉材料, 旨在利用DNA分子卓越的自組裝和識別能力, 將其作為一種納米材料可實(shí)現(xiàn)精確的自下而上的納米構(gòu)筑, 從而設(shè)計(jì)各種功能納米結(jié)構(gòu)[11～18]. 框架核酸巨大的研究價值和技術(shù)效益已經(jīng)引起人們對該納米材料的極大關(guān)注. 與傳統(tǒng)的無機(jī)、有機(jī)、聚合物或納米粒子等材料相比, 框架核酸具有接近原子尺寸的精度, 可以任意構(gòu)建并控制納米結(jié)構(gòu)的形狀與結(jié)構(gòu), 并且可以將功能化的小分子、生物大分子或納米顆粒進(jìn)行可控定點(diǎn)組裝[圖1(A)][19～24]. 更重要的是, 框架核酸具有優(yōu)良的生物相容性, 它可以連接在細(xì)胞膜表面或被細(xì)胞主動吸收, 并在細(xì)胞內(nèi)膜或外膜上發(fā)揮相應(yīng)的功能[25～27].

Fig.1 Schematic representations of framework nucleic acids(A) FNAs are truly monodispersed nanostructures with precise size, shape and manipulation manipulation[11]; Copyright 2018, American Chemical Society. (B) schematic of nanostructures and TEM images for framework nucleic acids with various shapes. Scale bars, zoomed-out 100 nm and zoomed-in 50 nm[32]. Copyright 2018, Springer Nature.

目前, 利用DNA納米技術(shù)和相關(guān)的納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)軟件[28,29]可構(gòu)建多種不同維度及形狀的框架核酸: 從簡單的幾何圖形(三角形、正方形等)到復(fù)雜的非幾何結(jié)構(gòu), 從二維的平面形狀到三維的彎曲立體結(jié)構(gòu)[30～32][圖1(B)]. 在構(gòu)筑框架核酸時, DNA折紙法是最常用的構(gòu)建方法[31]. 在該方法中, 以含7千多堿基的M13單鏈DNA作為“模板”, 加入特定序列的數(shù)百條DNA短鏈; 在一定的高溫下, 通過DNA互補(bǔ)配對原則, 這些數(shù)百條短鏈DNA“釘”在“模板”長鏈的支架上, 然后在數(shù)小時至數(shù)天的過程中緩慢冷卻DNA, 使構(gòu)成該結(jié)構(gòu)的DNA鏈退火, 從而構(gòu)建了各種二維和三維納米結(jié)構(gòu)[33,34]. 此外, Jungmann等[35]發(fā)現(xiàn), 通過緩慢降低變性劑(如甲酰胺或尿素)的濃度, 亦可以使DNA納米結(jié)構(gòu)在恒定溫度下自組裝, 為DNA納米結(jié)構(gòu)的合成提供了新方法. 之后, 以該DNA納米結(jié)構(gòu)作為框架, 可將各種功能化的化學(xué)基團(tuán)或納米材料修飾在特定位置, 從而構(gòu)建具有各種不同功能與形狀的框架核酸.

1.2 框架核酸的表征

形狀與結(jié)構(gòu)的表征是構(gòu)建框架核酸過程中的重要步驟. 常用的結(jié)構(gòu)表征方法有電泳、原子力顯微鏡(AFM)、透射電子顯微鏡(TEM)、動態(tài)光散射(DLS)及小角X線散射(SAXS)等[36]. 由于原子力顯微鏡與透射電子顯微鏡能夠清晰地展示框架核酸的精細(xì)形狀及復(fù)雜排布, 因此在其結(jié)構(gòu)表征中具有舉足輕重的作用. 其中, 原子力顯微鏡不僅可以提供框架核酸的結(jié)構(gòu)形態(tài)和大小信息, 同時可以實(shí)時監(jiān)測框架核酸的折疊路徑和反應(yīng)機(jī)理. 如, Dunn等[37]利用原子力顯微鏡實(shí)時、原位觀測了“瓷磚”框架核酸的二聚體折疊過程, 并通過加入相應(yīng)的“訂書釘”短鏈來引導(dǎo)該框架核酸二聚體的折疊路徑, 實(shí)現(xiàn)了框架核酸形貌及結(jié)構(gòu)的實(shí)時控制. 但是在成像過程中, AFM的懸臂梁會不斷對樣品施加力, 使三維的框架核酸失去形狀穩(wěn)定性并坍塌成平面結(jié)構(gòu), 因此原子力顯微鏡無法準(zhǔn)確反映三維框架核酸的立體結(jié)構(gòu)[38]. 因此, 在表征三維立體的框架核酸輔助的仿生膜時, 研究者更多選用成像效果更好的透射電子顯微鏡來表征其形狀與結(jié)構(gòu)[39]. 如, Langecker等[40]利用TEM精確地觀測到框架核酸構(gòu)建的仿生離子通道附著在脂質(zhì)胞囊上. 此外, Andersen等[41]證明小角X線散射亦可以原位表征框架核酸的特征輪廓.

2 框架核酸輔助的仿生膜的組裝類型

框架核酸與脂類聚合物的相互作用方式?jīng)Q定著仿生膜的結(jié)構(gòu)與性能, 一直以來都是仿生膜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 在組裝框架核酸輔助的仿生膜的過程中, 框架核酸與脂類聚合物在各種較弱作用的共同作用下逐步形成結(jié)構(gòu)有序且穩(wěn)定的仿生膜系統(tǒng). 具體來講, DNA帶有負(fù)電荷且親水性強(qiáng), 框架核酸無法直接嵌入到疏水的脂質(zhì)聚合物中. 但是, 利用框架核酸的可尋址性和納米級定位精度的能力, 在框架核酸上引入特定的連接基團(tuán), 從而使框架核酸嵌入到脂類聚合物中或吸附在其表面, 并實(shí)現(xiàn)仿生膜的界面調(diào)控和功能改造. 框架核酸輔助的仿生膜的形成主要依靠框架核酸與脂類聚集體之間的疏水作用、靜電作用以及適配體-靶標(biāo)分子之間的相互作用等方式(圖2).

Fig.2 Schematic representations of different anchoring methods for framework nucleic acids to lipid membranes(A) Porphyrins modified Framework nucleic acids with ed onto lipid membrane via hydrophobic effect[44], Copyright 2011, Wiley-VCH; (B) schematic representation of the DNA-lipid interaction via electrostatic interaction[51], Copyright 2006, American Chemical Society; (C) aptamer specifically bind to the EpCAM protein on cell surface, triggering DNA hybridization reaction to form DNA hydrogel[59], Copyright 2017, American Chemical Society.

2.1 疏水相互作用

疏水作用是框架核酸錨定在仿生膜上最常見的非共價形式. 疏水相互作用是一種非極性分子之間弱的、非共價的相互作用. 通過在框架核酸上定點(diǎn)修飾疏水基團(tuán), 利用非極性分子在水相環(huán)境中具有避開水而相互聚集的特性, 從而將框架核酸錨定在脂質(zhì)膜內(nèi). 其中, 卟啉作為一種疏水基團(tuán), 由于其自身具有傳遞電子與進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移的能力, 適合作為光物理和氧化還原活性的脂錨[42,43]. 如, 為了研究疏水基團(tuán)及脂質(zhì)膜對框架核酸的影響, Borjesson等[44]將疏水分子——卟啉修飾在框架核酸上, 并使框架核酸錨定在細(xì)胞膜表面; 然后, 利用熒光漂白恢復(fù)技術(shù)觀測框架核酸在膜上的擴(kuò)散行為, 發(fā)現(xiàn)框架核酸在膜上可以自由擴(kuò)散; 同時, 熔融實(shí)驗(yàn)證明框架核酸在膜上能進(jìn)行熱誘導(dǎo)的可逆組裝, 為研究框架核酸的自修復(fù)機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)[圖2(A)]. 此外, 膽固醇能自發(fā)地插入脂質(zhì)雙分子層, 是另一種常用的錨定基團(tuán)[45～47]. 如, Johnson-Buck等[48]將膽固醇修飾在矩形的框架核酸的底面, 利用單粒子熒光顯微鏡觀測到框架核酸在脂質(zhì)雙層上結(jié)合并能進(jìn)行橫向擴(kuò)散運(yùn)動. 從側(cè)面證明框架核酸可以作為膜結(jié)構(gòu)的超分辨率探針, 用于對生物膜的連續(xù)區(qū)域及位置進(jìn)行高精度繪制, 從而提供一種新穎、可控的方法來表征活細(xì)胞內(nèi)的生物膜和細(xì)胞骨架組織. 除膽固醇外, 聚環(huán)氧丙烷[49]和β-生育酚[50]也被用作鏈接基團(tuán)修飾在框架核酸上, 并成功地將框架核酸結(jié)構(gòu)嵌入脂膜中.

2.2 靜電力作用

框架核酸與仿生膜之間的靜電作用驅(qū)動的自組裝也被廣泛應(yīng)用于仿生膜的構(gòu)建中. 與疏水作用不同, 靜電相互作用根據(jù)所帶粒子電性不同表現(xiàn)出吸引力或排斥力: 帶相同電荷的粒子之間表現(xiàn)出排斥力, 帶不同電荷之間的粒子表現(xiàn)出吸引力. Gromelski等[51]發(fā)現(xiàn), 通過調(diào)控溶液中陽離子的濃度及種類, 可以精確調(diào)整框架核酸與仿生膜的結(jié)合行為. 具體來講, 在Mg2+或Ca2+等二價陽離子存在下, 陽離子會插入到帶兩性離子的脂質(zhì)中, 并中和脂質(zhì)的負(fù)電荷, 從而產(chǎn)生凈正電荷. 而該帶正電荷的脂質(zhì)體可與帶負(fù)電荷的框架核酸相互吸引, 從而介導(dǎo)框架核酸吸附在脂膜之上[圖2(B)].

2.3 適配體-靶標(biāo)分子之間的相互作用

框架核酸也能通過特定的適配體與靶標(biāo)之間的相互作用形成仿生膜體系. 盡管適配體與靶標(biāo)分子之間的相互作用不是共價修飾, 但是它們之間的親和力強(qiáng). 更重要的是, 適配體識別能力強(qiáng)、選擇性高, 可特異結(jié)合仿生膜上特定的膜蛋白[52～58]. 本課題組[59]利用適配體對循環(huán)腫瘤細(xì)胞膜表面上皮細(xì)胞黏附因子的特異性結(jié)合能力, 開發(fā)出新型的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的DNA水凝膠, 并用于腫瘤循環(huán)細(xì)胞的捕獲和釋放. 該水凝膠的形成不會破壞細(xì)胞的活性, 為收集循環(huán)血液中關(guān)于原發(fā)性腫瘤的準(zhǔn)確信息提供了新方法[圖2(C)].

3 框架核酸輔助的仿生膜的應(yīng)用領(lǐng)域

如前所述, 框架核酸可以通過不同的作用方式鏈接在脂膜上, 并形成新型的仿生膜系統(tǒng)及材料. 該仿生膜不僅具有框架核酸原有的性質(zhì), 而且在結(jié)構(gòu)、形狀、光學(xué)以及靶向能力等方面具有優(yōu)異的特性, 并在仿生膜形狀的調(diào)控、生物分子的檢測與成像、門控運(yùn)輸以及納米醫(yī)學(xué)及疾病診療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用.

3.1 仿生膜的形狀調(diào)控

在過去的幾十年里, 科研人員開發(fā)了各種構(gòu)建人工囊泡或脂質(zhì)膜的方法, 并作為研究細(xì)胞生物學(xué)的模型及用于開發(fā)新型的藥物載體[60]. 由于生物膜的幾何結(jié)構(gòu)決定了其物理和化學(xué)性質(zhì)(如融合原性、與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性及對酶修飾的敏感性等), 因此精確調(diào)控仿生膜的形狀和結(jié)構(gòu)是重要的研究方向[61,62]. 基于此, 利用框架核酸可編程及形狀精確的特性, 可通過模仿天然膜雕刻蛋白來構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)和形狀的框架核酸作為仿生膜的“外骨骼”, 從而調(diào)控仿生膜的結(jié)構(gòu)與形狀. 如, 為了研究生物膜的曲率對細(xì)胞運(yùn)輸、信號傳遞等功能的影響, Franquelim等[63]設(shè)計(jì)了3種不同曲率的基于框架核酸的仿生雕刻蛋白, 并觀測仿生膜在這些框架核酸中的生長過程及變化情況. 結(jié)果表明, 框架核酸的曲率直接決定仿生膜的形狀及內(nèi)陷形變程度等, 為進(jìn)一步研究生物膜變形背后的物理過程及原理提供了依據(jù)[圖3(A)]. 類似地, Birkholz等[64]構(gòu)建了多個基于框架核酸的仿生膜蛋白并插入到脂質(zhì)層中, 從而模仿并研究細(xì)胞胞吞過程中的膜受體聚集現(xiàn)象, 發(fā)現(xiàn)框架核酸會在脂質(zhì)層的彎曲處富集并進(jìn)一步誘導(dǎo)生成生物膜突起. 此外, 為了進(jìn)一步控制生物膜的管狀形變, Grome等[65]模仿內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)機(jī)械的螺旋結(jié)構(gòu), 將框架核酸設(shè)計(jì)成一個螺旋狀的卷曲結(jié)構(gòu). 這種卷曲結(jié)構(gòu)會誘導(dǎo)Snf7蛋白在仿生膜上組裝成螺旋狀, 從而引起囊泡變形和小管的形成.

除了控制囊泡的形狀, 精確控制脂質(zhì)囊泡的大小也是重要的研究方向. 如, Yang等[66]開發(fā)了一種基于框架核酸的“外骨架”, 使仿生膜有序生長, 從而實(shí)現(xiàn)生物膜尺寸控制[圖3(B)]. Zhang等[67]進(jìn)一步對這種框架核酸“外骨架”進(jìn)行組裝、排列和重塑, 構(gòu)建了形狀復(fù)雜、彎曲的工程仿生膜. 盡管這些基于框架核酸的仿生結(jié)構(gòu)尚處于初級階段, 但為研究生物膜重塑機(jī)制提供了新方法和工具, 也為復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)械的發(fā)展鋪平道路.

Fig.3 Representative examples of FNAs for shaping membrane(A) Framework nucleic acids with a variety of curvatures developed to study their abilities to shape membranes[68], Copyright 2018, American Chemical Society; (B) schematic of the FNA “exoskeleton” to confine the size of liposomes products[69], Copyright 2019, Wiley-VCH.

3.2 仿生“門控”蛋白的納米通道

生物膜上的跨膜蛋白是分子進(jìn)入細(xì)胞的通道, 負(fù)責(zé)控制生化物質(zhì)及信號的流入和流出. 如, 離子通道可以響應(yīng)化學(xué)、光或機(jī)械等刺激而打開或關(guān)閉離子傳輸, 選擇性地控制特定離子通過膜的流動, 該離子通道的開關(guān)調(diào)節(jié)又被稱為“門控”調(diào)節(jié). 目前研究者對“門控”蛋白的仿生設(shè)計(jì)研究興趣極大. 但因傳統(tǒng)仿生材料(如多肽和有機(jī)聚合物等)無法精確控制其結(jié)構(gòu), 從而限制了該領(lǐng)域的研究和發(fā)展. 而框架核酸的精確可控性使其可被折疊成多種精確結(jié)構(gòu), 從而滿足創(chuàng)建人工通道的各種需求. 如, 為了驗(yàn)證框架核酸能否仿生跨膜蛋白結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)其門控功能, Maingi等[70]通過中空的螺旋框架核酸與烷基組成的外部疏水帶的結(jié)合將其插入到仿生膜中, 利用分子模擬計(jì)算方法研究了該框架核酸在仿生膜中的穩(wěn)定性和構(gòu)象動力學(xué), 并發(fā)現(xiàn)框架核酸的疏水基團(tuán)為其在脂質(zhì)雙層中的穩(wěn)定性提供了能量保障.

設(shè)計(jì)動態(tài)納米通道是實(shí)現(xiàn)“門控”功能的關(guān)鍵. 基于此, Burns等[71]設(shè)計(jì)了一個帶有“分子門”的框架核酸納米通道: 該納米通道在底部有一個簡單的DNA“鎖”結(jié)構(gòu). 通過加入DNA“鑰匙”, 利用DNA雜交原理可將DNA “鎖”移除, 從而開啟納米通道. 他們發(fā)現(xiàn), 該納米通道對帶電分子有很高的選擇性, 能夠?qū)崿F(xiàn)小分子有序和可控釋放[圖4(A)]. 類似地, 結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù), Peng等[72]構(gòu)建了一個膽固醇修飾的桶狀跨膜框架核酸, 實(shí)現(xiàn)了生物分子的雙向智能選擇性通過. 該框架核酸擁有2個不同的結(jié)合區(qū)域, 分別控制生物分子的流入與流出. 具體來講, 在ATP存在的情況下, 外部的納米通道會打開并讓溶液中游離的Zn2+離子進(jìn)入仿生膜囊泡中. 這些Zn2+離子會進(jìn)一步觸發(fā)仿生膜內(nèi)的信號網(wǎng)絡(luò), 在經(jīng)歷信號接收、轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)等過程后, 發(fā)出反饋分子信號從而關(guān)閉內(nèi)部的納米通道, 最終完成反饋調(diào)節(jié). 該框架核酸仿生膜的構(gòu)建為設(shè)計(jì)更智能的分子網(wǎng)絡(luò)體系、分子信號系統(tǒng)以及人工細(xì)胞提供了一種新策略[圖4(B)].

Fig.4 Representative examples of framework nucleic acids for “Gated” transportation(A) Schematic of opening the Framework nucleic acids based nanopore with single stand DNA of “key” [68], Copyright 2018, American Chemical Society; (B) schematic illustration of artificial molecular signaling system[72], Copyright 2020, Springer Nature.

除了構(gòu)建納米通道來控制分子的運(yùn)輸和信息的交流, 納米通道亦被用來研究天然納米通道的門控機(jī)制及機(jī)理. 如, 在生物體內(nèi)離子類型和離子強(qiáng)度的變化直接決定跨膜蛋白的結(jié)構(gòu), 從而影響離子穿透膜蛋白通道的能力. 然而, 現(xiàn)有的技術(shù)難以觀測到鹽離子構(gòu)濃度對跨膜蛋白通道的結(jié)構(gòu)或形狀的影響. 為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo), Liu等[73]設(shè)計(jì)了6-螺旋束(6HB)納米管形狀的框架核酸. 通過分子模擬, 并結(jié)合小角X射線散射和熒光分析等實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 溶液及管道中的Mg2+離子會中和納米管道內(nèi)部的負(fù)電荷, 從而使納米通道展現(xiàn)成致密狀態(tài)(“II”形); 而將溶液替換為單價的Na+離子后, 則使其變?yōu)榕蛎洃B(tài)(“O”形). 該結(jié)果直接證明納米管道在不同生理?xiàng)l件下會發(fā)生形態(tài)重構(gòu), 為其實(shí)現(xiàn)仿生通道選擇性“門控”功能的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).

3.3 生物分子檢測與細(xì)胞成像

利用框架核酸構(gòu)建的仿生納米通道開發(fā)能夠檢測單個分子的納米孔傳感器是仿生膜研究領(lǐng)域中另一個重要的方向. 盡管基于天然蛋白的納米孔檢測方法展現(xiàn)出優(yōu)異的電學(xué)性能并實(shí)現(xiàn)了單分子傳感的目標(biāo), 但現(xiàn)有的蛋白質(zhì)工程方法無法設(shè)計(jì)或調(diào)控納米孔的幾何形狀和尺寸, 阻礙了納米孔檢測靈敏度及選擇性的進(jìn)一步提高, 從而限制該方法的應(yīng)用[74]. 相比之下, 形狀可控的框架核酸為定制化的納米孔構(gòu)建提供了新的方法和材料. 如, 受天然通道蛋白(α-溶血素)的啟發(fā), Langecker等[40]開發(fā)了一種基于桶狀結(jié)構(gòu)的框架核酸仿生納米孔, 并實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)雙層的穿透仿生離子通道的構(gòu)建. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 該穿膜框架核酸納米孔的電導(dǎo)約為1 ns, 比蛋白質(zhì)離子通道高出幾個數(shù)量級, 體現(xiàn)了良好的離子運(yùn)輸能力, 同時具有單DNA堿基錯配的分辨能力(見圖5). 此外, G?pfrich等[75]制備了一種截面積為6 nm的基于框架核酸的仿生孔蛋白, 可將納米孔的電導(dǎo)率提高至40 ns, 為生物大分子的痕量檢測奠定了基礎(chǔ).

Fig.5 Framework nucleic acids based nanopore for single molecule detection[68](A) Schematic design of the channel consisting of a barrel-shaped cap(white) and a transmembrane stem(red); (B) representative TEM images of DNA channels adhering to small unilamellar vesicles(SUVs). Copyright 2018, American Chemical Society.

此外, 將框架核酸錨定在細(xì)胞膜內(nèi), 用以監(jiān)測活體細(xì)胞內(nèi)的生理微環(huán)境變化, 如核酸、蛋白質(zhì)、離子、小分子、pH及溫度等, 是另一個具有潛力與前景的應(yīng)用方向[76～83]. 如, He等[84]設(shè)計(jì)了一種基于熵驅(qū)動的四面體框架核酸放大器, 該放大器能通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并錨定在細(xì)胞內(nèi)膜上, 從而觀測細(xì)胞內(nèi)mRNA的濃度變化和時空分布, 并探究活細(xì)胞狀態(tài)與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系. 為了研究細(xì)胞內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞活性的影響, Zhou等[85]設(shè)計(jì)了一種雙色編碼的四面體框架核酸探針, 用于同時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)多種有毒金屬離子的狀態(tài). 本課題組[86]利用多支化的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)獲得了具有多種生物蛋白的長螺旋枝狀結(jié)構(gòu), 從而捕獲外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞. 該方法的檢測限達(dá)到4個癌細(xì)胞, 可用于對癌癥預(yù)后與腫瘤轉(zhuǎn)移情況的評估.

3.4 納米醫(yī)學(xué)與疾病診療

藥物傳遞和釋放過程中均涉及生物膜的相互作用. 利用框架核酸仿生膜實(shí)現(xiàn)靶向載藥與治療是納米醫(yī)學(xué)中最有前景的研究領(lǐng)域[86～88]. 2011年, 本課題組[89]發(fā)現(xiàn)四面體框架核酸較容易被細(xì)胞內(nèi)吞; Kim等[90]用四面體框架核酸將抗癌藥物阿霉素(DOX)遞送到耐藥乳腺癌細(xì)胞, 并實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的靶向治療. 之后, 為了探索框架核酸進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制, 本課題組[91]采用分子動力學(xué)模擬方法研究了框架核酸在進(jìn)入細(xì)胞膜過程中的變化. 模擬結(jié)果顯示, 為了減少脂質(zhì)膜與框架核酸之間的靜電斥力, 正四面體框架核酸采用“角攻擊”的方式接近帶細(xì)胞膜, 從而與細(xì)胞膜表面的小窩蛋白結(jié)合, 并進(jìn)入細(xì)胞中. 除了四面體框架核酸外, Wang等[92]測試了其它不同大小、形狀的框架核酸(棒狀、三角架狀等)的細(xì)胞攝取情況, 發(fā)現(xiàn)長徑比高的框架具有更高的攝取效率.

除了提高細(xì)胞的攝取效率外, 框架核酸的特異拓?fù)渚幊探Y(jié)構(gòu)能進(jìn)一步提高其對生物膜蛋白的靶向識別能力. 如, 本課題組[93]提出了四面體框架核酸控制的方法, 對細(xì)胞膜上的受體配體進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì). 我們通過精確控制四面體上的適配體數(shù)量及位置, 誘導(dǎo)細(xì)胞膜上的配體進(jìn)行拓?fù)渲嘏? 引起簇狀受體的主動募集-結(jié)合, 最終提高其與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合能力及捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的效率[圖6(A)]. 此外, Ge等[94]報道了一種靶向配體修飾框架核酸, 可作為靶向前列腺癌治療的抗體藥物偶聯(lián)載體. 作為藥物偶聯(lián)的抗體, 抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)被修飾到框架核酸中的6個螺旋束中, 而抗癌藥物阿霉素(Dox)則通過疏水作用插入到框架核酸中的雙鏈DNA中. 該納米復(fù)合材料可選擇性地將Dox傳遞到表達(dá)PSMA的癌細(xì)胞系中[圖6(B)]. 此外, Ma等[95]在四面體框架核酸上錨定了一個乳腺癌生物標(biāo)志物HER2的適配體, 該框架核酸會特異性結(jié)合乳腺癌細(xì)胞膜上的乳腺癌膜蛋白HER2, 從而誘導(dǎo)該癌細(xì)胞溶酶體降解及細(xì)胞凋亡.

Fig.6 Representative examples of framework nucleic acids for biomedical engineering and drug delivery(A) Schematic illustration of the FNA based n-simplexes and recruitment-binding induced EpCAM cluster on the cell membrane with increased binding affinity[93], Copyright 2019, American Chemical Society; (B) schematic illustration of the framework nucleic acids as drug carriers[94], Copyright 2020, Wiley-VCH.

4 總結(jié)與展望

隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展, 人們已經(jīng)可以構(gòu)建復(fù)雜、動態(tài)的框架核酸. 將具有納米精度可控的形狀及操控分子能力的框架核酸與基于脂質(zhì)的生物膜體系組裝, 可以構(gòu)建具有諸多功能的仿生膜體系及新型材料, 并成為仿生膜的重要構(gòu)建方式以及研究途徑. 通過在框架核酸上修飾疏水基團(tuán)和特異性適配體, 或調(diào)控溶液中離子濃度和種類, 可使親水性高、帶負(fù)電性的框架核酸穩(wěn)定地嵌入在仿生膜中或吸附在仿生膜表面, 并發(fā)揮相應(yīng)的仿生功能. 同時, 受天然膜蛋白的啟發(fā), 目前已開發(fā)出多功能的框架核酸仿生膜材料, 并在納米技術(shù)、納米醫(yī)學(xué)、仿生學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和合成生物學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用. 如, 構(gòu)建膜上各組分有序排布的組裝體系; 模仿離子通道控制分子遞送; 模仿膜雕刻蛋白對細(xì)胞膜形狀的調(diào)控等; 通過對堿基進(jìn)行特定的修飾(如適配體等)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高效捕獲、智能定向載藥及癌癥靶向治療等. 由于框架核酸的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上的天然蛋白質(zhì)簇相似, 框架核酸可以作為細(xì)胞內(nèi)外運(yùn)輸?shù)娜斯らT控部件, 用于調(diào)控細(xì)胞環(huán)境和調(diào)控細(xì)胞信號. 更重要的是, 將框架核酸與細(xì)胞膜結(jié)合將進(jìn)一步推動人工細(xì)胞工程、細(xì)胞組裝的進(jìn)一步發(fā)展. 框架核酸在檢測分析中仍然面臨諸多挑戰(zhàn). 例如, 如何最大限度地減少體內(nèi)核酸酶對框架核酸的降解, 以維持框架核酸在細(xì)胞及活體環(huán)境下的穩(wěn)定性并減輕不必要的免疫反應(yīng), 是亟待解決的科學(xué)問題. 由于血清中的蛋白質(zhì)(如白蛋白)可與兩親性框架核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物[78], 從而阻止或破壞框架核酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與功能, 因此另一個大的挑戰(zhàn)是如何開發(fā)出新方法防止兩親性框架核酸與血清蛋白相互作用, 保持兩親性框架核酸在生物膜上的活性, 以擴(kuò)大其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用. 同時, 利用框架核酸仿生膜進(jìn)行天然膜蛋白之間的相互作用及動態(tài)變化過程等方面的研究有待進(jìn)一步深入. 此外, 受天然膜機(jī)器豐富多樣性的啟發(fā), 更精細(xì)的框架核酸結(jié)構(gòu)具有與更復(fù)雜的脂質(zhì)膜(如核膜)共同發(fā)揮作用的潛力. 因此, 需構(gòu)建更多具有精細(xì)功能的框架核酸仿生膜來實(shí)時調(diào)控生命活動的運(yùn)行, 深入推進(jìn)框架核酸輔助的仿生膜系統(tǒng)在癌癥靶向治療和臨床診療等領(lǐng)域中的應(yīng)用.