高 霞, 潘會(huì)賓, 喬成芳, 陳鳳英, 周 元, 楊文華

(1. 商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院, 陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 商洛 726000;2. 陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 大分子科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西安 710119;3. 商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共基礎(chǔ)教學(xué)部, 商洛726000)

染料廢水具有成分復(fù)雜、有機(jī)物濃度和色度高及難生化降解等特點(diǎn), 是難處理的工業(yè)廢水之一. 處理染料廢水的常用方法有生物法、吸附法、萃取法和化學(xué)法等[1～7]. 有機(jī)染料對(duì)水中生物具有致畸、致癌和致突變作用, 危害水中魚類等各種生物的生存. 此外還會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重?fù)p害, 如導(dǎo)致人體腎臟、生殖系統(tǒng)、肝臟、大腦和中樞神經(jīng)的功能性障礙[8～10]. 因此染料廢水的降解一直是研究熱點(diǎn), 大多數(shù)染料因毒性強(qiáng)、種類多、色度大等性質(zhì), 不僅有誘發(fā)人類癌癥的可能, 且給環(huán)境保護(hù)造成極大的威脅. 酶具有高效的催化活性, 同時(shí)兼具良好的特異性、反應(yīng)條件溫和、來源廣泛及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn), 因此酶催化降解染料具有一定的應(yīng)用前景[11～14]. 然而, 游離酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及有機(jī)溶劑中容易失活及反應(yīng)后分離純化困難, 難以回收重復(fù)利用, 而使用固定化酶可以使催化劑與產(chǎn)物得以分離, 實(shí)現(xiàn)酶的循環(huán)重復(fù)使用. 固定化酶一個(gè)最大的用途就是處理工業(yè)廢水中的有毒物質(zhì), 防止水體污染. 利用固定化過氧化物酶的催化氧化作用來處理酚類、芳香胺類、染料類廢水的污染是近年來受到重視的新方法, 降解的結(jié)果有效地降低了有毒有機(jī)污染物的含量和毒性, 是一種有效的廢水處理方法[11,12,15～19].

在固定化酶載體選擇方面, 金屬有機(jī)骨架(MOFs)材料由于具有較大的比表面積、孔道可調(diào)控性以及孔徑分布的均一穩(wěn)定性等優(yōu)良特性而成為理想的固定化酶載體. 近年來, 人們對(duì)MOFs材料在酶固定化中的應(yīng)用進(jìn)行了研究, 并取得了一定的成果[20～26]. Kim等[20]將采用水熱處理后合成法得到的一種新型微孔MOF[POST-66(Y)]進(jìn)行水熱處理得到的多級(jí)孔MOFs分別對(duì)維生素B12(VB12), 細(xì)胞色素C(Cyt C), 肌紅蛋白(Myoglobin)和辣根過氧化物酶(HRP)4種酶進(jìn)行固定化, 固定后的酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性. Ding等[21]采用模板法制備得到了一種具有雙級(jí)孔結(jié)構(gòu)(3.5和7 nm)的新型Zr-MOF(MMU)材料, 采用物理吸附法實(shí)現(xiàn)對(duì)漆酶的固定, 固定化酶具有較高的穩(wěn)定性, 重復(fù)使用10次后還能保持50%的初始活力, 在水相中儲(chǔ)存21 d后仍保留55.4%的初始活力, 可作為一種新型材料應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域.

本文采用自組裝模板法制備了多級(jí)孔Zr-MOF材料, 以多級(jí)孔Zr-MOF材料為載體, 采用吸附法固載辣根過氧化物酶(HRP), 以染料結(jié)晶紫的催化降解脫色反應(yīng)為模型反應(yīng)考察了酶的催化活性, 探討了游離酶及其固定化酶反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性, 并考察了其實(shí)際應(yīng)用情況.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

HRP(純度≥95%)購于北京索萊寶科技有限公司; 對(duì)苯二甲酸(H2BDC, 純度99%)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 純度>99.5%)購于梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司; 四氯化鋯(ZrCl4, 純度99%)和苯甲酸(HBC, 純度99%)購于Sigma-Aldrich公司; 乙酸銅和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫均為分析純, 購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 無水乙醇(分析純)購于天津化學(xué)試劑廠; 結(jié)晶紫(純度99%)購于天津市福晨化學(xué)試劑廠.

D/Max-3C型全自動(dòng)X射線衍射儀(XRD, 日本Rigalcu公司); UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì)(島津國際貿(mào)易上海有限公司); ASAP 2460系列物理吸附儀(美國麥克公司); FV1200型激光共聚焦顯微鏡(CLSM, 日本奧林巴斯公司); SU8220型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM, 日本Rigalcu公司); JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM, 日本電子公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 多級(jí)孔Zr-MOF的制備 將0.120 g ZrCl4、0.166 g對(duì)苯二甲酸、一定質(zhì)量的HBC(5, 10或15 mmol)、0.181 g乙酸銅和10 mL DMF置于20 mL內(nèi)襯為聚四氟乙烯的水熱反應(yīng)釜中, 超聲30 min, 密封后在5 h內(nèi)升溫至120 ℃, 恒溫72 h, 然后緩慢冷卻至室溫, 產(chǎn)物依次用DMF和丙酮多次洗滌, 得到白色復(fù)合物(含模板劑的Zr-MOF材料), 向復(fù)合物中加入5 mL HCl溶液(0.1 mol/L), 置于恒溫振蕩器振蕩10 min以除去動(dòng)態(tài)模板劑; 離心, 除去上清液后用丙酮洗滌多次, 于60 ℃真空干燥12 h, 即可得到多級(jí)孔Zr-MOF載體材料. 通過改變孔徑調(diào)節(jié)劑HBC的用量, 可得到不同孔徑的樣品, 并分別標(biāo)為Zr-MOF-1, Zr-MOF-2和Zr-MOF-3.

1.2.2 HRP@Zr-MOF的制備 將50 mg多級(jí)孔Zr-MOF載體材料置于150 ℃真空中活化12 h, 備用. 將5 mg活化后的多級(jí)孔Zr-MOF載體材料加入pH值為2.5～5.0的0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液和150 μL 10 mg/mL HRP溶液中, 體系總體積為1.5 mL. 混合均勻后, 于恒溫振蕩器中以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩20～120 min, 再將混合物以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min, 分離上清液與固體, 并用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌除去載體表面游離的HRP, 于30 ℃真空干燥12 h得到多級(jí)孔Zr-MOF固定化HRP, 標(biāo)記為HRP@Zr-MOF. 采用紫外分光光度計(jì)測定上清液中殘留HRP的濃度進(jìn)而計(jì)算酶的固載量, 固載量(mg/g)的計(jì)算公式為

(1)

式中: ΔA為HRP在紫外波長403 nm處的吸光度值變化;V(mL)為實(shí)驗(yàn)體系的最終體積;ε(102000 L·mol-1·cm-1)為HRP的摩爾吸光系數(shù);l(cm)為實(shí)驗(yàn)中所用比色皿的寬度;m(g)為加入Zr-MOF的質(zhì)量.

保持固定化條件不變, 分別考察固定化時(shí)間(20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 min)、pH值(2.5, 2.75, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0)和固定化溫度(20, 25, 30, 35, 40 ℃)等因素對(duì)Zr-MOF對(duì)HRP固載量的影響, 從而確定其固定化的最優(yōu)條件.

1.2.3 HRP催化降解結(jié)晶紫脫色反應(yīng) 向2 mL用鋁箔裹住的離心管中加入一定體積0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液, 然后加入一定量的游離HRP或HRP@Zr-MOF(5 mg載體固載HRP的量)和75 μL 10 mmol/L結(jié)晶紫溶液, 再向反應(yīng)體系中加入一定體積H2O2溶液, 保持最終體積為1.5 mL. 室溫下避光反應(yīng)5 min后離心. 采用紫外分光光度計(jì)測定降解前后的結(jié)晶紫在紫外特征吸收波長(584 nm)處的吸光度值, 并計(jì)算染料的降解率(η, %):

(2)

式中:A0和At分別為染料降解前后在584 nm處的吸光度值.

1.2.4 熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性測定 將30 μL 10 mg/mL的游離HRP與含等量HRP的HRP@Zr-MOF加入到一定體積的0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液中, 并置于20～100 ℃溫度下溫育0～180 min, 再將溫育過的游離HRP和HRP@Zr-MOF用于結(jié)晶紫催化降解反應(yīng), 比較游離HRP和HRP@Zr-MOF的熱穩(wěn)定性.

將30 μL 10 mg/mL的游離HRP及含等量HRP的HRP@Zr-MOF儲(chǔ)存在室溫下持續(xù)56 d, 每7 d用結(jié)晶紫催化降解反應(yīng)的降解率來表征其催化活性, 定義最初反應(yīng)的催化活性為100%, 其它時(shí)間的降解率與之比較來計(jì)算酶的相對(duì)活性.

1.2.5 重復(fù)使用性測定 將HRP@Zr-MOF用于結(jié)晶紫催化降解反應(yīng), 完成一次催化反應(yīng)后, 經(jīng)離心分離并用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌, 繼續(xù)用于后續(xù)催化反應(yīng), 將第一次使用HRP@Zr-MOF的催化活性記作100%, 之后每次的催化活性與第一次進(jìn)行比較, 以殘余催化活性表征HRP@Zr-MOF的重復(fù)使用性.

2 結(jié)果與討論

2.1 HRP@Zr-MOF的設(shè)計(jì)構(gòu)筑策略

采用自組裝模板法, 選擇不穩(wěn)定的Cu-MOF為模板劑, HBC為孔徑調(diào)節(jié)劑, 設(shè)計(jì)得到3種孔徑的Zr-MOF材料. 將它們作為固相載體, 利用物理吸附法固載HRP. 以結(jié)晶紫的催化降解反應(yīng)為模型考察了3種固定化酶反應(yīng)器的催化活性, 結(jié)果表明, 載體孔徑對(duì)固定化酶反應(yīng)器的催化活性有較大影響. 由表1可以看出, 3種Zr-MOF材料的平均孔徑分別為4.2, 8.6和12.8 nm, 其中Zr-MOF-2材料具有相對(duì)較高的酶催化活性. 根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道, 游離HRP的分子尺寸為4.0 nm×4.4 nm×6.8 nm. 以上結(jié)果表明, 游離HRP分子難以進(jìn)入到Zr-MOF-1材料孔道中. 此外, 還要求MOF的孔徑足夠大, 為酶分子提供一個(gè)翻轉(zhuǎn)空間來發(fā)揮催化作用. 由于Zr-MOF-1不適合固載HRP, 而Zr-MOF-2的孔道可以提供足夠的空間來容納HRP以及進(jìn)行催化過程. 進(jìn)一步擴(kuò)大Zr-MOF孔徑至12.8 nm時(shí), 酶反應(yīng)器的催化活性略有降低, 推測可能的原因是隨著材料孔徑的增大, 固載到孔道中的酶分子增多, 由于介孔孔道的限域效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致酶分子發(fā)生團(tuán)聚, 從而使底物的擴(kuò)散阻力增大, 酶催化活性降低. 因此, 選擇Zr-MOF-2作為HRP固定化的載體. 此外, 由于介孔孔道的限域效應(yīng), 可以推測出Zr-MOF-2中HRP是以“酶的單陣列方式包埋”的方式存在于一個(gè)孔道中, 這樣就可以避免酶分子的團(tuán)聚和催化活性的損失.

Table 1 Pore sizes of Zr-MOF and catalytic activity of HRP@Zr-MOF

2.2 Zr-MOF固定化HRP條件的優(yōu)化

圖1為Zr-MOF固定化HRP過程中醋酸-醋酸鈉緩沖液pH值、固定化時(shí)間及溫度對(duì)固定效果的影響結(jié)果. 由圖1(A)可見, 緩沖液pH值分別設(shè)定為2.5, 2.75, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5和5.0時(shí), 固定化最適pH值在3.0左右; 由圖1(B)可見, 將反應(yīng)時(shí)間依次設(shè)定為20, 30, 40, 50, 60, 90和120 min時(shí), 60 min后酶的固載量基本不變, 可能與物理吸附法固定化酶達(dá)到吸附平衡有關(guān), 所以最佳固定化時(shí)間為60 min; 由圖1(C)可見, 將反應(yīng)溫度依次設(shè)定為20, 25, 30, 35和40 ℃時(shí), 酶的固載量先增大后減小, 這可能是因?yàn)闇囟冗^高吸附后酶分子脫附而影響固載量, 所以最佳固定化溫度為30 ℃. 綜上所述, 以多級(jí)孔Zr-MOF為載體, 固定化HRP的最佳固定化條件: pH=3.0、固定化時(shí)間60 min、固定化溫度30 ℃, 固載量最高可達(dá)61.6 mg/g.

Fig.1 Effects of the pH values(A), time(B) and temperatures(C) on the immobilization of HRP with Zr-MOF

下面以Zr-MOF-2為載體, 在最佳固定化條件下, 討論Zr-MOF和HRP@Zr-MOF的形貌結(jié)構(gòu)以及HRP@Zr-MOF的染料降解催化性能.

2.3 多級(jí)孔Zr-MOF及其HRP@Zr-MOF的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 N2吸附-脫附分析 將制備的3種Zr-MOF材料于150 ℃下脫氣12 h后, 在液氮溫度(77 K)下進(jìn)行氮?dú)馕?脫附測試, 圖2(A)為3種Zr-MOF材料的氮?dú)馕?脫附曲線, 圖2(B)為采用BJH模型計(jì)算得到的材料孔徑分布曲線. 如圖2(A)所示, 3種Zr-MOF材料的氮?dú)馕?脫附曲線具有較明顯的第Ⅳ類等溫線特征, 屬于典型的介孔固體材料的吸附, 存在滯后環(huán), 表明材料具有介孔結(jié)構(gòu). 由表1和圖2(B)可見, 3種Zr-MOF材料均含有3類大小不同的孔道. 根據(jù)已有文獻(xiàn)[21]報(bào)道, 結(jié)合氮?dú)馕?脫附測試結(jié)果, 進(jìn)一步表明所制備的材料為多級(jí)孔材料.

Fig.2 N2 adsorption-desorption isotherms(A) and pore size distributions(B) of Zr-MOF

Fig.3 PXRD patterns of Zr-MOF(a), Zr-MOF after activation(b) and simulate UiO-66(c)(A)and PXRD patterns of Zr-MOF after activation(a) and HRP@Zr-MOF(b)(B)

2.3.2 X射線粉末衍射(PXRD)分析 圖3(A)為多級(jí)孔Zr-MOF材料活化前后以及UiO-66的PXRD譜圖. 可見, 多級(jí)孔Zr-MOF材料活化前后的特征衍射峰一致, 證明多級(jí)孔Zr-MOF材料經(jīng)活化后仍能保持很好的結(jié)構(gòu)完整性, 骨架未發(fā)生坍塌. 多級(jí)孔Zr-MOF材料與UiO-66的特征衍射峰基本吻合, 表明此類材料屬于UiO-66系列材料. 為了進(jìn)一步研究HRP的存在對(duì)多級(jí)孔Zr-MOF結(jié)構(gòu)造成的影響, 通過PXRD對(duì)HRP@Zr-MOF(固定化條件: pH=3.0、固定化時(shí)間60 min、溫度30 ℃)進(jìn)行了表征[見圖3(B)]. 可見, HRP@Zr-MOF仍呈現(xiàn)出UiO-66的2個(gè)特征衍射峰(2θ=7.3°, 8.5°), 由此表明HRP的引入不會(huì)對(duì)多級(jí)孔Zr-MOF的結(jié)構(gòu)造成影響.

2.3.3 FESEM和TEM分析 對(duì)Zr-MOF載體及其HRP@Zr-MOF固定化酶反應(yīng)器進(jìn)行了FESEM和TEM測試, 結(jié)果分別見圖4和圖5. 由圖4可見, Zr-MOF的尺寸及形貌與HRP@Zr-MOF的基本類似, 均呈現(xiàn)直徑約為80 nm尺寸均一的六邊形納米結(jié)構(gòu). 由酶固定化前后材料形貌(圖5)對(duì)比可知, 固定化酶后的Zr-MOF材料上粒子數(shù)目明顯增多. 由此可知, 酶分子已經(jīng)固定在Zr-MOF材料上, 且Zr-MOF材料的形貌幾乎未改變, 進(jìn)一步說明酶分子的引入未改變Zr-MOF材料的結(jié)構(gòu).

Fig.4 FESEM images of Zr-MOF(A) and HRP@Zr-MOF(B)

Fig.5 TEM images of Zr-MOF(A) and HRP@Zr-MOF(B)

2.3.4 CLSM分析 將用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記HRP制備的FITC-HRP@Zr-MOF用于激光共聚焦顯微鏡測試, 圖6(A)為Zr-MOF材料的激光共聚焦顯微鏡照片, 圖6(B)為引入Zr-MOF的FITC-HRP的激光共聚焦顯微鏡照片, 圖6(C)為圖6(A)和(B)的疊加圖. 圖6(B)和(C)中可見許多均勻分布的綠色熒光斑點(diǎn), 由于Zr-MOF材料不是熒光材料, 通過觀察得知圖6(A)中確實(shí)沒有出現(xiàn)綠色熒光斑點(diǎn), 因此所觀察到的熒光信號(hào)來自于引入Zr-MOF的FITC-HRP. 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HRP被固載到了Zr-MOF材料的整體骨架結(jié)構(gòu)中.

Fig.6 Laser confocal microscopy images of the Zr-MOF(A) and FITC-HRP@Zr-MOF(B,C)

Fig.7 UV-Vis absorbance spectra of oxidation degradation of crystal violet catalyzed by free HRP and HRP@Zr-MOF

2.4 HRP@Zr-MOF的催化活性

通常, 造成固定化酶反應(yīng)器催化活性降低或損失主要有2個(gè)原因: 酶與載體之間的相互作用使得酶分子表面氨基酸殘基的構(gòu)象以及活性位點(diǎn)的微環(huán)境發(fā)生改變, 從而導(dǎo)致酶催化活性的降低; 底物在固相載體中的傳質(zhì)阻力相對(duì)于在溶液本體中會(huì)增大. 圖7給出了利用酶催化降解結(jié)晶紫脫色反應(yīng)來表征游離HRP和HRP@Zr-MOF的催化活性. 可見, 與游離HRP相比, HRP@Zr-MOF可以保留96.8%的催化活性. HRP@Zr-MOF之所以能保持較高的催化活性是由于Zr-MOF載體自身的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì), 其介孔孔徑(8.6 nm)可以與游離HRP(4.4 nm×4.4 nm×6.8 nm)的尺寸相匹配, 底物可以富集在固載酶分子的介孔周圍的微孔中, 從而使其傳質(zhì)阻力減小. 此外, 由介孔孔道的限域效應(yīng)可以推測出在Zr-MOF中酶分子是以單陣列的方式包埋于通道中, 從而避免了酶分子的團(tuán)聚.

2.5 HRP@Zr-MOF的操作穩(wěn)定性

2.5.1 HRP@Zr-MOF的熱穩(wěn)定性 由于溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的速率有很大的影響, 因此限制了酶在工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際運(yùn)用. 升高溫度, 酶催化反應(yīng)速率會(huì)增大, 然而超過酶催化反應(yīng)的最適溫度后, 升溫會(huì)破壞酶的三維結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致催化活性的降低. 圖8(A)給出了游離HRP和HRP@Zr-MOF在20～100 ℃條件下溫育1 h的熱穩(wěn)定性. 可見, 隨著溫度的升高, 游離HRP和HRP@Zr-MOF催化結(jié)晶紫染料脫色反應(yīng)的催化活性呈“鐘罩型”變化, 游離HRP的最佳反應(yīng)溫度在40 ℃左右, 超過50 ℃后催化活性明顯下降. HRP@Zr-MOF在50 ℃左右催化活性最高, 并且在較高溫度下仍保持了較高的催化活性, 如70 ℃時(shí), HRP@Zr-MOF仍能保持接近80%的催化活性, 游離HRP幾乎失去全部活性. 圖8(B)給出了游離HRP和HRP@Zr-MOF在60 ℃條件下溫育0～3 h的熱穩(wěn)定性. 可見, 隨著溫育時(shí)間的延長, 游離HRP和HRP@Zr-MOF的催化活性均下降, 溫育3 h后, HRP@Zr-MOF仍能保持90.2%的催化活性, 而游離HRP僅能保持29.5%的催化活性. 以上結(jié)果表明, HRP@Zr-MOF的熱穩(wěn)定性較游離HRP顯著提高, 這是由于Zr-MOF骨架結(jié)構(gòu)具有較高的熱穩(wěn)定性, 可為包埋于其中的酶分子提供剛性屏蔽環(huán)境, 限制了酶分子在高溫下的伸展和特異性聚集, 從而提高了酶的熱穩(wěn)定性[27].

Fig.8 Temperature stability of free HRP and HRP@Zr-MOF

Fig.9 Effects of pH values on the catalytic activity of free HRP and HRP@Zr-MOF

2.5.2 HRP@Zr-MOF的酸堿穩(wěn)定性 酶由蛋白質(zhì)組成, 其催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是pH值非常敏感, pH值過高或過低, 一方面會(huì)破壞酶的三維結(jié)構(gòu), 造成酶蛋白分子變性失活; 另一方面會(huì)導(dǎo)致酶分子表面存在的氨基酸殘基側(cè)鏈上的基團(tuán)發(fā)生解離, 造成底物無法與酶蛋白結(jié)合或底物不能被酶分解為產(chǎn)物. 圖9給出了反應(yīng)體系的pH值對(duì)染料結(jié)晶紫催化降解的影響. 由圖9可知, 反應(yīng)體系的pH值對(duì)染料結(jié)晶紫的催化降解影響很大. 在pH=2.5～6.0時(shí), 酶催化降解染料的降解率隨pH值的增加呈先增大后減小的趨勢(shì), 結(jié)晶紫的最佳降解pH值約為5.0. 當(dāng)pH值>5.0時(shí), 游離HRP和HRP@Zr-MOF對(duì)結(jié)晶紫的降解率均呈下降趨勢(shì), 但在相同pH值條件下, HRP@Zr-MOF的催化效率總是高于游離HRP, 這說明Zr-MOF的孔道骨架能夠?yàn)镠RP提供良好的屏蔽場所, 減少了pH值對(duì)游離HRP殘基側(cè)鏈基團(tuán)解離狀態(tài)的影響, HRP@Zr-MOF固定化酶反應(yīng)器具有更好的耐受酸堿環(huán)境的優(yōu)勢(shì).

2.5.3 HRP@Zr-MOF對(duì)H2O2的穩(wěn)定性 H2O2是HRP催化氧化反應(yīng)中一種重要的氧化劑, 但高濃度的H2O2不利于酶分子中亞鐵血紅素的催化反應(yīng), 主要是由于酶的活性中心卟啉環(huán)的破壞導(dǎo)致酶分子失活[28]. 圖10給出了反應(yīng)體系中H2O2濃度對(duì)染料結(jié)晶紫催化降解的影響. 可見, 染料結(jié)晶紫催化降解的最佳H2O2濃度為0.3 mmol/L. 當(dāng)H2O2濃度小于0.3 mmol/L時(shí), 游離HRP和HRP@Zr-MOF對(duì)結(jié)晶紫的降解率相差不大, 游離HRP甚至比HRP@Zr-MOF更有優(yōu)勢(shì), 但當(dāng)H2O2濃度大于0.3 mmol/L后, 游離HRP的降解率下降明顯, 而HRP@Zr-MOF的降解率下降較為緩慢, 表明HRP@Zr-MOF對(duì)高濃度的H2O2有較好的抵抗力.

Fig.10 Effects of H2O2 concentration on the catalytic activity of free HRP and HRP@Zr-MOF

Fig.11 Storage stability of free HRP and HRP@Zr-MOF

2.5.4 HRP@Zr-MOF的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 圖11為游離HRP及其HRP@Zr-MOF在室溫條件下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性曲線. 可見, HRP@Zr-MOF的儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離HRP. 在室溫下保存56 d后, 游離HRP僅能保持不到30.0%的催化活性, 而HRP@Zr-MOF仍能保持85.6%的催化活性. 結(jié)果表明, 游離HRP固載之后形成的酶反應(yīng)器的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較游離酶顯著提高, 在室溫下就能保存較長的時(shí)間, 這是由于游離HRP固載之后, 酶活性中心表面的微環(huán)境發(fā)生了變化, 酶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定, 減少了外界環(huán)境對(duì)酶活性的影響, 使得酶在室溫下仍能較好的保持其催化活性[29].

2.6 HRP@Zr-MOF的重復(fù)使用性

游離酶難以從反應(yīng)體系中分離出來重復(fù)使用, 將其固載到固相載體中后, 就可以通過固液分離實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用, 大大降低生產(chǎn)成本, 并可以在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用[30]. 圖12為HRP@Zr-MOF在結(jié)晶紫脫色降解反應(yīng)中的重復(fù)使用情況. 可見, 隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加, HRP@Zr-MOF的催化活性緩慢下降, 在重復(fù)使用10次后仍能保持62.3%的催化活性. 介孔MOF(Tb-TATB)固定化酶反應(yīng)器[31]在重復(fù)使用7次后, 僅能保持53.0%的催化活性; MOF固定化葡萄糖淀粉酶反應(yīng)器[32]在重復(fù)使用6次后, 僅能保持57.0%的催化活性. 與上述文獻(xiàn)結(jié)果相比, 本文制備的HRP@Zr-MOF酶反應(yīng)器具有相對(duì)較好的重復(fù)使用性, 這主要源于Zr-MOF屬于一種高穩(wěn)定的多級(jí)孔MOF材料, 其被用于固載酶除了具有MOFs材料自身的優(yōu)點(diǎn)外, 還具有多級(jí)孔結(jié)構(gòu)和水溶液高穩(wěn)定性兩大優(yōu)勢(shì).

Fig.12 Operational reusability of HRP@Zr-MOF

Fig.13 Decolorization of crystal violet with HRP@Zr-MOF in actual wastewater

2.7 HRP@Zr-MOF在染料降解中的應(yīng)用研究

為了考察HRP@Zr-MOF催化降解結(jié)晶紫染料的實(shí)際應(yīng)用能力, 選取了西安市周邊秦鎮(zhèn)水、灃峪水、黑河水和人工湖4種水源作為實(shí)驗(yàn)水樣, 選用相同條件下的醋酸-醋酸鈉緩沖液作為對(duì)照樣, 向水樣和對(duì)照樣中加入等量的結(jié)晶紫染料, 分別用HRP@Zr-MOF催化結(jié)晶紫脫色, 結(jié)果見圖13. 可見, HRP@Zr-MOF對(duì)秦鎮(zhèn)水、灃峪水、黑河水和人工湖實(shí)驗(yàn)水樣中結(jié)晶紫的降解率均在5 min內(nèi)達(dá)到90%以上, 且其對(duì)實(shí)驗(yàn)水樣中結(jié)晶紫的催化效率較對(duì)緩沖液中略低, 可能是由于實(shí)際水樣中存在的多種金屬離子或微生物等會(huì)對(duì)HRP的催化活性產(chǎn)生影響. 以上結(jié)果表明, HRP@Zr-MOF可在自然水源中應(yīng)用于催化結(jié)晶紫染料降解反應(yīng)體系, 此類固定化酶反應(yīng)器作為一種綠色的固體催化劑在染料廢水的處理方面具有極為廣闊的應(yīng)用前景.

3 結(jié) 論

采用自組裝模板法制備多級(jí)孔Zr-MOF, 并將HRP固載到多級(jí)孔Zr-MOF中構(gòu)筑HRP@Zr-MOF酶反應(yīng)器. 通過N2吸附-脫附分析、XRD、FESEM、TEM及CLSM等表征結(jié)果證實(shí)已成功制備了多級(jí)孔Zr-MOF載體, 且游離HRP被成功固載到Zr-MOF的孔道中, 而并非表面吸附. HRP@Zr-MOF固定化酶反應(yīng)器表現(xiàn)出比游離酶更優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、H2O2穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性; 重復(fù)使用10次后, HRP@Zr-MOF的相對(duì)活性仍能保持62.3%. HRP@Zr-MOF用于催化降解結(jié)晶紫染料具有反應(yīng)時(shí)間較短、酶用量少、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn), 在5 min內(nèi)降解率高達(dá)90%以上, 適合應(yīng)用于實(shí)際染料降解體系中.