甘歡華，劉鐘棟，吳 凱，李 華，魏國(guó)華

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.宜春大海龜生命科學(xué)有限公司，江西 宜春 336000)

大豆油脫臭餾出物是油脂精煉脫臭環(huán)節(jié)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要由游離脂肪酸、生育酚、植物甾醇、角鯊烯、甘油酯及烴類等物質(zhì)組成[1-2]。隨著人們生活水平的提高及油脂精煉技術(shù)的進(jìn)步，我國(guó)油脂行業(yè)生產(chǎn)規(guī)模不斷壯大，油脂脫臭餾出物產(chǎn)量也在不斷增加，所以加強(qiáng)對(duì)油脂脫臭餾出物的綜合利用研究變得尤為重要[3-6]。

大豆油脫臭餾出物的綜合利用主要是提取其中的生育酚、植物甾醇和角鯊烯[7-9]。由于脫臭餾出物中含有大量的游離脂肪酸和部分甘油酯，兩者性質(zhì)與生育酚相似，不易分離，需要進(jìn)行甲酯化處理，使游離脂肪酸或甘油酯與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)，這樣既降低了脂肪酸和甘油酯的沸點(diǎn)，使生育酚更容易分離，又能降低體系黏度，通過(guò)降溫將植物甾醇從酯化液中分離出來(lái)，可進(jìn)一步提高生育酚的純度[10-13]。

目前，傳統(tǒng)油脂脫臭餾出物甲酯化工藝一般采用濃硫酸、氫氧化鈉、酶等作為催化劑，但均存在一定的缺點(diǎn)[14]。如濃硫酸會(huì)對(duì)設(shè)備產(chǎn)生腐蝕，污水處理難度大，不利于環(huán)境保護(hù)；強(qiáng)堿催化劑在水存在的情況下容易與原料發(fā)生皂化反應(yīng)，不利于生物活性成分的分離提取[15-17]；Novozyme 435、Lipozyme TL IM等脂肪酶作催化劑成本較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[18]。

Eversa Transform 2.0脂肪酶具有反應(yīng)時(shí)間短、酶活高、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本研究以大豆油脫臭餾出物為原料，Eversa Transform 2.0脂肪酶[19]作為催化劑，以反應(yīng)前后酸價(jià)的變化為考察指標(biāo)，對(duì)甲酯化工藝進(jìn)行研究，并采用薄層色譜法對(duì)甘油三酯的轉(zhuǎn)化進(jìn)行分析，以期為大豆油脫臭餾出物的酶法甲酯化工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆油脫臭餾出物(酸價(jià)(KOH)138.83 mg/g)，中國(guó)儲(chǔ)備糧管理集團(tuán)有限公司；Eversa Transform 2.0脂肪酶(產(chǎn)品特性見(jiàn)表1)，諾維信中國(guó)技術(shù)有限公司；甘油三酯、VE、甲酯、甲醇、乙醇、氫氧化鉀等均為分析純。

硅膠板；HX1001電子天平；FA2004B電子天平；GS12-2型電子恒速攪拌器；R201D型恒溫水浴鍋。

表1 Eversa Transform 2.0脂肪酶產(chǎn)品特性

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆油脫臭餾出物酶法甲酯化反應(yīng)

稱取100 g大豆油脫臭餾出物于250 mL三口燒瓶中，水浴加熱至反應(yīng)溫度，加入一定量的Eversa Transform 2.0脂肪酶，加入一定量的甲醇，控制攪拌速率為200 r/min，反應(yīng)一定時(shí)間。由于甲醇對(duì)Eversa Transform 2.0脂肪酶有一定的破壞作用，所以甲醇需要緩慢滴加，防止過(guò)量的甲醇使酶產(chǎn)生中毒而降低反應(yīng)效率。反應(yīng)完全后，將酯化液靜置分層，取上層清液測(cè)定酸價(jià)。

1.2.2 酸價(jià)的測(cè)定和酯化率的計(jì)算

按 GB/T 5530—2005測(cè)定酸價(jià)。

酯化率=(反應(yīng)前樣品的酸價(jià)-反應(yīng)后樣品的酸價(jià))/反應(yīng)前樣品的酸價(jià)×100%

1.2.3 薄層色譜法分析甘油三酯的轉(zhuǎn)化[20]

將樣品(包括A.甘油三酯標(biāo)樣；B.甲酯標(biāo)樣；C.VE標(biāo)樣；D.大豆油脫臭餾出物；E.添加10%甘油三酯的大豆油脫臭餾出物；F.以添加甘油三酯的大豆油脫臭餾出物為原料經(jīng)酯化反應(yīng)得到的樣品)用正己烷溶解，配成120 mg/mL的溶液。展開(kāi)劑正己烷-乙醚-乙酸(體積比85∶15∶1)，硅膠板預(yù)處理后進(jìn)行點(diǎn)樣，在展開(kāi)劑中展開(kāi)，展開(kāi)結(jié)束后，放入烘箱烘干，再放入充滿碘蒸氣的容器中顯色，出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，計(jì)算Rf值進(jìn)行定性。根據(jù)酯化前后斑點(diǎn)的大小變化，直觀測(cè)定甘油三酯含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆油脫臭餾出物酯化率的影響

在反應(yīng)溫度40℃、醇酸摩爾比(甲醇與游離脂肪酸摩爾比，下同)3∶1、酶用量0.3%(相對(duì)于大豆油脫臭餾出物的質(zhì)量，下同)條件下，分別考察反應(yīng)時(shí)間2、4、6、8、10 h對(duì)酯化率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響

由圖1可知：大豆油脫臭餾出物在Eversa Transform 2.0脂肪酶的催化下，與甲醇反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，在前4 h反應(yīng)較快；反應(yīng)6 h時(shí)，酯化率基本達(dá)到最大值，之后反應(yīng)趨于平衡狀態(tài)。這是由于酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，在反應(yīng)前一段時(shí)間，反應(yīng)物較多，反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，反應(yīng)速率較快，隨著反應(yīng)體系中水量的增加，正反應(yīng)方向受到抑制，反應(yīng)速率下降，最終達(dá)到平衡狀態(tài)。考慮到工業(yè)化能源的消耗，選取反應(yīng)時(shí)間6 h為宜。

2.1.2 酶用量對(duì)大豆油脫臭餾出物酯化率的影響

在反應(yīng)溫度40℃、醇酸摩爾比3∶1、反應(yīng)時(shí)間6 h條件下，分別考察酶用量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%對(duì)酯化率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶用量對(duì)酯化率的影響

酶在反應(yīng)中起催化作用，能加快反應(yīng)速率，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，但不直接參與反應(yīng)。由圖2可知，隨著酶用量增加，酯化率先升高后下降，在酶用量為0.2%時(shí)，酯化率達(dá)到最大值。酯化率下降是由于此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，酶用量增加，正逆反應(yīng)速率加快，反應(yīng)體系中生成的水越多，反應(yīng)向逆反應(yīng)方向進(jìn)行。所以，選取酶用量0.2%為宜。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)大豆油脫臭餾出物酯化率的影響

在醇酸摩爾比3∶1、反應(yīng)時(shí)間6 h、酶用量0.2%的條件下，分別考察反應(yīng)溫度30、35、40、45、50℃對(duì)酯化率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酯化率的影響

反應(yīng)溫度既能影響酶的催化活性，又能影響其穩(wěn)定性。由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，酯化率先升高后下降，在40℃時(shí)，酯化率達(dá)到最大值。溫度升高，酶的催化活性增大，酯化率升高，超過(guò)40℃時(shí)，酯化率下降較快，可能是因?yàn)闇囟绕?，?duì)酶產(chǎn)生了一定的破壞作用。所以，選取反應(yīng)溫度40℃為宜。

2.1.4 醇酸摩爾比對(duì)大豆油脫臭餾出物酯化率的影響

在反應(yīng)時(shí)間6 h、酶用量0.2%、反應(yīng)溫度40℃的條件下，分別考察醇酸摩爾比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1對(duì)酯化率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，大豆油脫臭餾出物的酯化率隨著醇酸摩爾比的增大先升高后快速下降，在醇酸摩爾比為3∶1時(shí)，酯化率達(dá)到最大值。這是由于在Eversa Transform 2.0脂肪酶不會(huì)因甲醇中毒的前提下，甲醇濃度的升高使反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，大豆油脫臭餾出物的酯化率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)甲醇濃度過(guò)高時(shí)，甲醇會(huì)對(duì)Eversa Transform 2.0脂肪酶產(chǎn)生破壞作用，使其催化活性降低甚至失去活性，導(dǎo)致大豆油脫臭餾出物的酯化率快速下降。綜合考慮，選取醇酸摩爾比3∶1為宜。

圖4 醇酸摩爾比對(duì)酯化率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，反應(yīng)時(shí)間、酶用量、反應(yīng)溫度、醇酸摩爾比這4個(gè)因素都會(huì)對(duì)大豆油脫臭餾出物的酯化率產(chǎn)生一定的影響。為了優(yōu)化反應(yīng)條件，選用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平如表2所示，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示。

由表3和表4可知：酶用量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率有極顯著性影響，反應(yīng)溫度對(duì)酯化率有顯著性影響，醇酸摩爾比對(duì)酯化率影響不顯著；各因素對(duì)酯化率影響的主次順序?yàn)锽>D>C>A，最佳反應(yīng)條件為A1B3C1D2，即醇酸摩爾比2∶1、酶用量0.3%、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表4 方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了使試驗(yàn)結(jié)果更具說(shuō)服力，本研究通過(guò)改變反應(yīng)物的質(zhì)量(相對(duì)于初始試驗(yàn)質(zhì)量的4、8、12倍)，進(jìn)行放大試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 最佳工藝條件下的放大試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，在原試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行重復(fù)放大試驗(yàn)(放大4、8、12倍)，在最佳工藝條件下，大豆油脫臭餾出物的酯化率都能達(dá)到95%以上，說(shuō)明本研究所得到的結(jié)果是真實(shí)可靠的。

2.4 甲酯化工藝中甘油三酯的轉(zhuǎn)化

在最佳工藝條件下，通過(guò)薄層色譜法測(cè)定甲酯化反應(yīng)前后大豆油脫臭餾出物中甘油三酯的含量變化，進(jìn)一步考察Eversa Transform 2.0脂肪酶的催化性能，結(jié)果如圖6所示。

注：A.甘油三酯標(biāo)樣；B.甲酯標(biāo)樣；C.VE標(biāo)樣；D.大豆油脫臭餾出物；E.添加10%甘油三酯的大豆油脫臭餾出物；F.以添加甘油三酯的大豆油脫臭餾出物為原料經(jīng)甲酯化反應(yīng)后得到的樣品；1.甘油三酯；2.甲酯；3.脂肪烴類物質(zhì)；4.α-生育酚；5.(β+γ)-生育酚；6.δ-生育酚；7.脂肪酸和VE混合物。

圖6 薄層色譜分析圖

由圖6可知，大豆油脫臭餾出物中主要含有脂肪烴類物質(zhì)、脂肪酸和VE，甘油三酯含量較少。為了更好地體現(xiàn)脂肪酶的催化性能，向脫臭餾出物中添加10%的甘油三酯標(biāo)樣，通過(guò)甲酯化反應(yīng)后，樣品F的色譜圖中出現(xiàn)較大的甲酯斑點(diǎn)，說(shuō)明酯化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，甘油三酯的斑點(diǎn)基本消失，進(jìn)而可以直觀地認(rèn)為甘油三酯反應(yīng)完全，說(shuō)明Eversa Transform 2.0脂肪酶具有催化甘油三酯發(fā)生酯交換反應(yīng)的作用。

2.5 酶法甲酯化工藝工業(yè)化實(shí)踐分析

針對(duì)該工藝實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的問(wèn)題，本文結(jié)合工廠實(shí)際做出以下分析：就目前而言，在工業(yè)化生產(chǎn)中，大豆油脫臭餾出物甲酯化工藝一般采用濃硫酸法，以酯化1 t大豆油脫臭餾出物為例，需要30～40 kg的濃硫酸作為催化劑，醇酸摩爾比為10∶1，甲醇消耗量大，反應(yīng)結(jié)束后的處理，會(huì)產(chǎn)生2 t的污水，污水處理成本是240元，工藝安全隱患大，并且濃硫酸會(huì)腐蝕設(shè)備，縮短設(shè)備的使用壽命，進(jìn)而提高生產(chǎn)成本；而酶法酯化，1 t原料需要消耗3 kg Eversa Transform 2.0脂肪酶，催化劑成本是360元，醇酸摩爾比為2∶1，甲醇消耗量小，也不會(huì)產(chǎn)生污水。兩種工藝生產(chǎn)成本相差不大，在一定的條件下，工廠完全可以承受酶法酯化的生產(chǎn)成本。所以，該工藝具有一定工業(yè)化實(shí)踐價(jià)值。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)以大豆油脫臭餾出物為原料，以Eversa Transform 2.0脂肪酶為催化劑，進(jìn)行酶法甲酯化工藝研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出最佳工藝條件為醇酸摩爾比(甲醇與游離脂肪酸摩爾比)2∶1、酶用量0.3%(相對(duì)于大豆油脫臭餾出物的質(zhì)量)、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)時(shí)間6 h；在最佳工藝條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行重復(fù)放大試驗(yàn)，酯化率達(dá)到95%以上，且甘油三酯基本轉(zhuǎn)化完全，說(shuō)明該試驗(yàn)方案真實(shí)可行。本工藝具有效率高、時(shí)間短、酶成本低等特點(diǎn)，在工業(yè)化生產(chǎn)上，不產(chǎn)生污水，對(duì)環(huán)境保護(hù)起到促進(jìn)作用，是一種可持續(xù)發(fā)展的工藝。