喬楊波，韓麗娟, 2，王樹林，院珍珍，秦艷婷

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016； 2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，西寧 810016)

蠶豆(ViciafabaL.)種植面積和產(chǎn)量均居于我國食用豆類之首，廣泛分布于云南、青海、甘肅等地[1-2]。青海作為我國春蠶豆的主產(chǎn)區(qū)之一，以生產(chǎn)大粒型品種為主，生產(chǎn)的蠶豆以粒大、色澤鮮亮、無蟲蛀而聞名[3-4]。蠶豆中蛋白質(zhì)含量可達25%～30%，僅次于大豆，遠高于水稻、小麥及其他作物，同時因蠶豆中淀粉含量豐富，脂肪含量較低，故可將其作為人類理想的植物蛋白質(zhì)來源[5-9]。隨著近年來研究不斷深入，越來越多的研究表明植物源多肽在人體生理調(diào)節(jié)過程中起著十分重要的作用，可以顯著提高人體免疫力，提高機體的抗氧化及抗衰老能力[10-12]。蠶豆在我國食品行業(yè)中的應(yīng)用主要利用其所含淀粉作為食品加工的重要原料，卻鮮少利用其中的蛋白質(zhì)進行食品工業(yè)生產(chǎn)，這不僅導(dǎo)致資源的大量浪費，同時也致使蠶豆多肽的研究始終處于初步階段[12]。

目前，主要以化學(xué)合成法、分離提取法、基因重組法及酶解法等制備植物源多肽[13]。酶解法因操作簡單，制備過程反應(yīng)條件溫和，且酶解后蛋白質(zhì)多肽得率高等優(yōu)點而被廣泛采納[14-15]。因此，為了更全面利用蠶豆資源，更深入地利用蠶豆蛋白，發(fā)揮其最大的生物利用價值，本文通過選用不同蛋白酶酶解蠶豆蛋白，對比酶解產(chǎn)物多肽得率、抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶活性的影響，為酶法制備高質(zhì)量、高活性的蠶豆多肽奠定一定的理論基礎(chǔ)，從而實現(xiàn)蠶豆蛋白及多肽的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

蠶豆，產(chǎn)自青海西寧；酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶，南京都萊生物技術(shù)有限公司；L-酪氨酸標準品、干酪素標準品、考馬斯亮藍G-250、標準牛血清白蛋白、福林酚、α-葡萄糖苷酶、ABTS試劑、DPPH試劑，北京索萊寶科技有限公司；VC，江蘇采薇生物科技有限公司；阿卡波糖，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、色氨酸、谷氨酸、酪氨酸標準品，美國Sigma公司；碳酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水乙醇、磷酸等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

QP2010 plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；KC-130小型粉碎機，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；UV-2600紫外可見分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GS55-9冷凍干燥機，基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶豆蛋白的提取

蠶豆蛋白的提取參考文獻[16]并略作改動，通過測定蠶豆蛋白等電點，采用等電點沉淀法提取蠶豆蛋白。取干燥、粉碎后的蠶豆粉末，加蒸餾水溶解，取上清液調(diào)節(jié)至不同pH(3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2)，通過考馬斯亮藍法確定蠶豆蛋白等電點為4.8。以蠶豆為原料，經(jīng)干燥、粉碎，加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至8左右，使得蠶豆蛋白溶解，取上清液將pH調(diào)節(jié)至蠶豆蛋白等電點，過濾取沉淀進行真空冷凍干燥即得到蠶豆蛋白。

1.2.2 蛋白酶活力測定

參考文獻[17]采用福林酚法繪制L-酪氨酸標準曲線。以吸光度(y)與L-酪氨酸標準品質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程y=0.009 6x+0.023 5，R2=0.999 7，按下式計算蛋白酶活力。

蛋白酶活力=A×(4/10)×N

式中：A為對照標準曲線得出的L-酪氨酸釋放量，μg/mL；10為酶解反應(yīng)總時間，min；4為酶解反應(yīng)試劑總體積，mL；N為酶液稀釋倍數(shù)(本實驗N為100)。

1.2.3 蠶豆蛋白酶解

將提取的蠶豆蛋白制為4%的酶解底物，調(diào)節(jié)pH至各蛋白酶酶解所需pH(酸性蛋白酶3.0、胃蛋白酶3.0、菠蘿蛋白酶7.5)，分別加入酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶，同時控制酶活力均為3 066.44 U/g，未處理組調(diào)節(jié)pH至中性但無蛋白酶添加。將處理組與未處理組均置于40℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴4 h，取出立即煮沸10 min滅酶，得到酶解液。離心取上清液，得到蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物。

1.2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

參考文獻[18]采用考馬斯亮藍法繪制蛋白質(zhì)標準曲線。以吸光度(y)與牛血清白蛋白標準品質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程y=0.006 7x+0.076，R2=0.999 1。根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.5 多肽得率測定

參考文獻[19]采用雙縮脲法繪制雙縮脲標準曲線。以吸光度(y)與牛血清白蛋白標準品質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程y=0.056 5x-0.002 3，R2=0.999 1。根據(jù)標準曲線計算蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物中多肽質(zhì)量濃度，按下式計算多肽得率。

多肽得率=C×V/M×100%

式中：C為酶解產(chǎn)物中多肽質(zhì)量濃度，mg/mL；V為酶解產(chǎn)物總體積，mL；M為蠶豆蛋白質(zhì)量，mg。

1.2.6 氨基酸含量測定

1.2.6.1 樣品前處理

取蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物于10 mL水解管中，加入6 mol/L的鹽酸，100℃酶解12 h。旋蒸除去鹽酸后，加入正丁醇100℃孵育1 h，旋蒸蒸干，50℃三氟乙酸酐乙酰化10 min。取等量的標準品采用同樣的方法進行衍生。加水終止反應(yīng)，二氯甲烷萃取，進行GC-MS分析。

1.2.6.2 GC-MS條件

GC條件：RXI-5SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件為起始溫度60℃，以4℃/min升溫至280℃，保持5 min；進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min。

MS條件：離子源溫度200℃，接口溫度230℃，延遲2 min，掃描范圍(m/z)43～400，掃描速度769 u/s，檢測時間2～56 min。

1.2.7 DPPH自由基清除率測定

將蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋至不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(96、48、24、16、12 μg/mL)，分別與DPPH溶液、無水乙醇混合(體積比1∶1)，靜置30 min，于517 nm處測定吸光度，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的VC為陽性對照，按下式計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac] ×100%

式中：Ai、Aj、Ac分別為樣品與DPPH、無水乙醇與樣品、DPPH與無水乙醇的吸光度。

1.2.8 ABTS自由基清除率測定

將蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋至不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(96、48、24、16、12 μg/mL)，與ABTS溶液混合(體積比1∶20)后于室溫下反應(yīng)6 min，在734 nm處測定吸光度，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的VC為陽性對照，按下式計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=(1-A樣品/A空白)×100%

1.2.9α-葡萄糖苷酶活性抑制率測定

將蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋至不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(48、24、12、6、3 μg/mL)，參考文獻[20]分別測定樣品組、樣品空白組、陰性對照組和空白組的吸光度，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的阿卡波糖為陽性對照，按下式計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率=[(A3-A4)-(A1-A2)]/(A3-A4)×100%

式中：A1、A2、A3和A4分別為樣品組、樣品空白組、陰性對照組和空白組的吸光度。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均表示為“X±SD”，采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶活力

利用福林酚法分別測定酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶活力，結(jié)果見表1。

表1 不同蛋白酶活力

2.2 蠶豆蛋白多肽得率的比較

采用雙縮脲法進行蛋白多肽得率測定，結(jié)果如圖1所示。

注：與未處理組比較*P<0.05，**P<0.01。 圖1 蠶豆蛋白多肽得率比較

由圖1可知，經(jīng)蛋白酶酶解后，蠶豆蛋白多肽得率呈現(xiàn)大幅度上升的趨勢(P<0.01)，上升幅度大小依次為胃蛋白酶>酸性蛋白酶>菠蘿蛋白酶。其中，胃蛋白酶處理后的蠶豆蛋白多肽得率高達39.14%，是未經(jīng)蛋白酶處理蠶豆蛋白多肽得率的9.05倍。不同酶催化酶解蠶豆蛋白時所斷裂的肽鍵數(shù)目不同，致使蠶豆蛋白酶解程度存在差異[21]，不同蛋白酶酶解位點不同，也會使酶解生成氨基酸的種類、數(shù)目及多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生差異，最終影響蛋白質(zhì)的多肽得率。

2.3 酶解前后蠶豆蛋白氨基酸含量的比較

采用GC-MS對酶解前后蠶豆蛋白的氨基酸組成及含量進行測定，對蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物定量分析了15種氨基酸成分，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，未處理組蠶豆蛋白中共檢出10種氨基酸，經(jīng)菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶酶解后分別檢出12、12、11種氨基酸。經(jīng)蛋白酶酶解后，異亮氨酸在蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物中未被檢出，纈氨酸與半胱氨酸被檢出。此外，經(jīng)菠蘿蛋白酶酶解后，谷氨酸被檢出，且除天冬酰胺與酪氨酸外，其他氨基酸含量均較未處理組有一定上升，其中以亮氨酸含量增加最為明顯，達到10.65%。經(jīng)酸性蛋白酶酶解后，甲硫氨酸與色氨酸被檢出，與未處理組相比，酶解產(chǎn)物中異亮氨酸與酪氨酸未被檢出。此外，除纈氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、酪氨酸外，其余氨基酸含量較其他處理組明顯上升。經(jīng)胃蛋白酶酶解后，與未處理組相比，除纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸外，其余各氨基酸含量均較未處理組顯著降低，其中又以酪氨酸含量降低最為明顯，為13.53%。因此，經(jīng)菠蘿蛋白酶和酸性蛋白酶酶解后可以明顯增加蠶豆蛋白中氨基酸的種類和含量。

表2 酶解前后蠶豆蛋白氨基酸組成及含量 %

注：“-”為未檢出。

2.4 蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除率(見圖2)

圖2 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率

由圖2可知，3種蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率的大小總體依次為酸性蛋白酶>菠蘿蛋白酶>胃蛋白酶。經(jīng)酸性蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為96 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率最高，達95.71%，超過陽性對照VC，并與菠蘿蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率(94.66%)相近；此外，經(jīng)酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶酶解后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率明顯高于經(jīng)胃蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，且清除率隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢。除蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為48 μg/mL外，經(jīng)3種酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，相較于蠶豆蛋白，對DPPH自由基的清除率都有顯著提升(P<0.05)，說明小分子的肽、氨基酸等物質(zhì)，相較于大分子蛋白質(zhì)，對于DPPH自由的基清除具有明顯優(yōu)勢，具有很強的抗氧化能力，值得進一步深入研究。

2.4.2 ABTS自由基清除率(見圖3)

圖3 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對ABTS自由基的清除率

由圖3可知，經(jīng)不同蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物相較于蠶豆蛋白，對ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)。同一蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對ABTS自由基的清除率明顯高于酸性蛋白酶與胃蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，當?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為96 μg/mL時，對ABTS自由基的清除率最高可達90.53%，ABTS自由基清除率相比于VC較低，但隨著其質(zhì)量濃度的不斷降低，ABTS自由基清除率明顯高于VC，說明經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物具很強的抗氧化能力且具有穩(wěn)定性。

2.5 蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率

研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖[22]。因此，開發(fā)對于α-葡萄糖苷酶具有抑制效用的藥物成為治療糖尿病食品或藥品的研發(fā)熱點。本文考察了蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率

由圖4可知：經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為48 μg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率可達88.10%，與陽性對照阿卡波糖(94.42%)相近，同時是未酶解蠶豆蛋白的1.78倍(P<0.01)；酸性蛋白酶、胃蛋白酶處理所得蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率較未處理組也有較大提升，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為48 μg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率分別達到77.63%與54.58%。根據(jù)氨基酸檢測結(jié)果(見表2)，推測可能是由于不同蛋白酶酶解所產(chǎn)生的氨基酸含量差異造成的。經(jīng)菠蘿蛋白酶酶解后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物，異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸未被檢出，但纈氨酸、半胱氨酸含量與其他組相比達到最大值。另外，除天冬酰胺與酪氨酸外，其余氨基酸含量較未處理組有一定增長，同時在菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物中有谷氨酸檢出。故此推測，可能是由于以上幾種氨基酸對α-葡萄糖苷酶的活性具有一定影響，進而致使菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率高于其他蛋白酶處理后的酶解產(chǎn)物，但具體作用機制還有待進一步深入研究。

3 結(jié) 論

本文就不同蛋白酶酶解對蠶豆蛋白的生物活性進行比較，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同蛋白酶酶解后的蠶豆蛋白多肽得率極顯著升高，作用效果依次為胃蛋白酶>酸性蛋白酶>菠蘿蛋白酶。經(jīng)菠蘿蛋白酶和酸性蛋白酶酶解后可明顯增加蠶豆蛋白中氨基酸的種類和含量；經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對ABTS自由基的清除率最大可達90.53%，對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率可達88.10%，經(jīng)酸性蛋白酶處理后的蠶豆蛋白酶解產(chǎn)物對于DPPH自由基清除率最大可達95.71%。因此，酶解蠶豆蛋白可以增強蠶豆蛋白自身的生物活性，顯著提高其抗氧化能力，有助于發(fā)揮其最大的生物價值。