張秀秀，李少華，薛秀恒，孔德瑞

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，合肥 230036)

DAG是油脂的天然成分，含量較低，具有降低餐后血脂水平、抑制體內(nèi)脂肪積累、緩解糖尿病、抗動脈粥樣硬化、防血栓、抑菌等功能特性。DAG主要存在兩種同分異構(gòu)體，即1,2-DAG和1,3-DAG，兩者比例為3∶7[1-4]。研究表明，1,3-DAG對抑制體脂積累和防止體重增加具有積極作用[5-8]。近年來關(guān)于動物油DAG的研究較多，但動物油DAG含有較多的飽和脂肪酸(SFA)，過多攝入飽和脂肪酸可誘導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生，對人體健康產(chǎn)生不利影響。因此，開發(fā)富含不飽和脂肪酸的植物油DAG用于食品生產(chǎn)十分重要。祝雨筱[9]采用高油酸葵花籽油與無水乙醇在油醇摩爾比1∶50、脂肪酶Lipozyme 435添加量6%(占底物總質(zhì)量)、反應(yīng)溫度50℃下反應(yīng) 1 h，1,2-DAG得率約為88%。DAG獨特的分子結(jié)構(gòu)同時具備較好的親油性和親水性，因此可作為乳化劑[10-12]應(yīng)用于食品及其他行業(yè)中。賀可琳等[13]將鴨油1,3-DAG作為一種食品添加劑加入脫脂奶粉中，發(fā)現(xiàn)添加一定量的鴨油1,3-DAG能明顯改善脫脂奶粉的分散性、沖調(diào)性和穩(wěn)定性。

葵花籽油是我國使用最廣泛的植物油之一，與動物油相比含有較多的多不飽和脂肪酸(PUFA)。其中亞油酸被譽為“血管清道夫”，具有保護心血管、降血脂、延緩衰老、提高免疫力、促進骨骼發(fā)育和提高記憶力等功能[14-16]。以葵花籽油為原料制備的富含亞油酸DAG不僅可以用于替代乳脂甘油三酯的功能性油脂，也可同時用于肥胖人群及其相關(guān)疾病人群的治療。但葵花籽油來源的DAG，由于富含不飽和脂肪酸，其與含飽和脂肪酸含量較高的乳脂DAG相比，質(zhì)構(gòu)特性有所不同。因此，利用制得的富含亞油酸DAG開發(fā)富含亞油酸DAG的發(fā)酵乳制品，并研究其品質(zhì)特性的變化具有一定的理論與實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葵花籽油(山東魯花集團有限公司)；富含1,3-DAG乳脂(提取自安佳黃油，上海恒天然貿(mào)易有限公司)；新西蘭安佳脫脂奶粉(上海恒天然貿(mào)易有限公司)；諾維信435脂肪酶(諾維信集團)；SH-486乳酸菌(丹麥科漢森有限公司)；氯化鈉、吐溫-80、氫氧化鈉、氨水、硫酸、乙醚、石油醚，分析純；甲醇、正己烷、異丙醇，色譜純(美國Fisher公司)。

CP244C電子天平，HH-S恒溫水浴鍋，F(xiàn)luko高速分散器(上海FlukoLU有限公司)，APV 2000超高壓納米均質(zhì)機(德國APV公司)，Allegra 64R型貝克曼高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)，7890B氣相色譜儀(美國Agilent公司)，Luna silica C18色譜柱(美國Phenomenex公司)，1525系列高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2414示差檢測器(美國Waters公司)，R/S Plus黏度計(美國Brookfield公司)，HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀(美國TA公司)，CT3質(zhì)構(gòu)儀(美國Brookfield公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葵花籽油DAG的制備

參照王志耕等[17]的方法并作改進。稱取葵花籽油、甘油、諾維信435脂肪酶于250 mL錐形瓶中，于氣浴恒溫振蕩器53℃、200 r/min條件下振蕩反應(yīng)一段時間。結(jié)束后，將上清液移入離心管中，以5 000 r/min離心5 min。收集上清液在70℃下加熱 10 min 以使殘留的酶失活，得到葵花籽油DAG。DAG含量的測定在實驗室已有的標準曲線基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法測定，具體方法參照文獻[17]。

1.2.2 脂肪酸組成及含量測定

參照GB 5009.168—2016方法對樣品進行前處理。色譜條件：HP-88氣相毛細管柱；氫火焰離子化檢測器溫度280℃；進樣口溫度250℃；分流比100∶1，載氣為氮氣,流量2 mL/min；進樣量1 μL。用相對保留時間定性，用峰面積歸一化法定量。

1.2.3 葵花籽油DAG的酸價、皂化值、碘值的測定

參照GB/T 5530—2005測定酸價，參照GB/T 5534—2008測定皂化值，參照GB/T 5532—2008測定碘值。

1.2.4 DAG部分替代乳脂酸奶的制備

1.2.4.1 酸奶的制備

將脫脂奶粉與蒸餾水以質(zhì)量比1∶7混合，加入5%白糖，分別加入2%葵花籽油DAG、乳脂DAG和乳脂,用高速分散器分散均勻；再通過超高壓納米均質(zhì)機將乳液混合均勻，90℃下水浴滅菌20 min；冷卻至42℃以下，接種0.07%的菌粉(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)，密封，42℃發(fā)酵4.5 h，然后置于4℃冰箱后熟18 h，得到3組酸奶樣品。

1.2.4.2 酸奶流變特性測定

靜態(tài)流變測定[18]：采用黏度計測量，使用具有CC40探頭的同軸圓筒夾具測量25℃下酸奶的流變性質(zhì)。每組測試均做3次平行。

動態(tài)流變測定：采用HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀對酸奶樣品進行測定，使用直徑40 mm圓形平行板，樣品與平行板間隙為1 mm，設(shè)置測量溫度25℃，掃描應(yīng)變0.2%，測定角頻率范圍為0～100 rad/s。

1.2.4.3 酸奶質(zhì)構(gòu)特性測定

使用CT3質(zhì)構(gòu)儀進行酸奶樣品的凝膠質(zhì)構(gòu)的測定。選擇P-36R探針，設(shè)置測定條件：測前速度2.0 mm/s，測試速度2.0 mm/s，測后速度2.0 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5 g。每組測試均做3次平行。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗用Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)的錄入和統(tǒng)計，采用SPSS 19統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差顯著性分析，采用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葵花籽油DAG制備單因素試驗

2.1.1 醇油質(zhì)量比對DAG含量的影響

在酶添加量7%、反應(yīng)時間12 h條件下，研究醇油質(zhì)量比(甘油與葵花籽油質(zhì)量比，下同) 對DAG含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 醇油質(zhì)量比對DAG含量的影響

由圖1可知，醇油質(zhì)量比達到1∶10時，DAG含量達到最大值，繼續(xù)增加葵花籽油量，DAG含量降低，這可能是由于隨著葵花籽油量增加，底物與酶的接觸面積降低。因此，最佳醇油質(zhì)量比為1∶10。

2.1.2 酶添加量對DAG含量的影響

在醇油質(zhì)量比1∶10、反應(yīng)時間12 h條件下，研究酶添加量對DAG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶添加量對DAG含量的影響

由圖2可知，酶添加量在4%～7%之間時，DAG含量隨著酶添加量的增加而逐漸升高，但酶添加量超過7%后，DAG含量呈下降趨勢。原因可能是脂肪酶含量過高時，大部分脂肪酶顆粒會沉積在容器底部，在該反應(yīng)條件下未能充分分散，導(dǎo)致底物與酶不能充分接觸。因此，最佳酶添加量為7%。

2.1.3 反應(yīng)時間對DAG含量的影響

在醇油質(zhì)量比1∶10、酶添加量7%條件下，研究反應(yīng)時間對DAG含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時間對DAG含量的影響

從圖3可以看出，DAG含量隨著反應(yīng)時間延長先上升后下降，反應(yīng)時間為12 h時， DAG含量達到最高值。因此，最佳反應(yīng)時間為12 h。

2.2 葵花籽油DAG制備的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

以醇油質(zhì)量比(A)、酶添加量(B)、反應(yīng)時間(C)為自變量，DAG含量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗優(yōu)化葵花籽油DAG制備工藝。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示，方差分析如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 方差分析

注：**表示影響極顯著(P<0.01)，*表示影響顯著(P<0.05)。

利用Design Expert軟件對表1試驗結(jié)果進行多元回歸擬合分析，得到DAG含量的二次多元回歸方程：Y=48.36+0.37A+1.04B+0.68C-0.068AB+0.14AC-0.12BC-1.24A2-4.16B2-2.05C2。

由表2可知：回歸模型P<0.01，說明回歸模型極顯著；失擬項P=0.105 4>0.05，失擬項不顯著，說明對葵花籽油DAG響應(yīng)面試驗的擬合情況較好，可以用于葵花籽油DAG制備工藝的優(yōu)化。對葵花籽油DAG含量的影響由大到小依次為酶添加量(B)>反應(yīng)時間(C)>醇油質(zhì)量比(A)。B2、C2對葵花籽油DAG含量影響極顯著(P<0.01)，B、A2、BC對葵花籽油DAG含量的影響顯著(P<0.05)，表明試驗因素對響應(yīng)值的交互作用關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.2 葵花籽油DAG制備最佳工藝條件的確定及驗證

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，可確定制備葵花籽油DAG的最佳工藝條件為醇油質(zhì)量比1∶10、酶添加量7.13%、反應(yīng)時間12.35 h，此時反應(yīng)產(chǎn)物中DAG含量為49.52%。在最佳工藝條件下進行3次驗證試驗，制得葵花籽油DAG中DAG平均含量為49.21%。實際值與預(yù)測值之間無顯著差異(P>0.05)。因此，基于此方法優(yōu)化的工藝條件準確可靠，有實用價值。

2.3 葵花籽油DAG脂肪酸組成

采用2.2優(yōu)化制備條件，以乳脂為原料制備乳脂DAG，檢測甘油解反應(yīng)前后葵花籽油與乳脂中的脂肪酸組成，結(jié)果如表3所示。

表3 反應(yīng)前后葵花籽油和乳脂脂肪酸含量變化 %

由表3可知，乳脂中脂肪酸組成主要為棕櫚酸，約占總脂肪酸的45%，反應(yīng)后飽和脂肪酸含量無顯著變化，但不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸含量有所下降。葵花籽油的亞油酸含量高達68.84%，甘油解反應(yīng)后不飽和脂肪酸含量下降，單不飽和脂肪酸含量升高,可能是酶解促進了亞油酸向油酸的轉(zhuǎn)化。

2.4 葵花籽油DAG的基本性質(zhì)(見表4)

表4 葵花籽油DAG的酸價、皂化值和碘值

由表4可知：由于反應(yīng)過程中產(chǎn)生了副產(chǎn)物游離脂肪酸，使得反應(yīng)后乳脂DAG和葵花籽油DAG的酸價升高；隨著甘油三酯含量減少，甘油二酯含量明顯增多，并出現(xiàn)甘油一酯，皂化值下降；反應(yīng)后不飽和脂肪酸含量降低，造成碘值下降，且葵花籽油相較于乳脂的碘值更高，這與植物油的不飽和脂肪酸含量較高有關(guān)。

2.5 不同DAG對酸奶流變特性的影響

2.5.1 靜態(tài)流變性質(zhì)(見圖4)

圖4 酸奶樣品的表觀黏度和觸變性

從圖4A可以看出，3組酸奶樣品表觀黏度隨剪切速率增加均呈逐漸下降后趨于平穩(wěn)趨勢，且均表現(xiàn)出假塑性流體特性。在剪切前期由于剪切應(yīng)力的增加，發(fā)酵乳液在外力作用下分子網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致乳液變稀，表觀黏度急劇下降。隨后表觀黏度呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，甚至趨于平穩(wěn)?？ㄗ延虳AG酸奶表觀黏度略高于乳脂DAG酸奶和乳脂酸奶。觸變環(huán)是剪切速率由低到高和由高到低的兩個對應(yīng)過程圖形的上行曲線和下行曲線之間形成的環(huán)狀回路，環(huán)面積越大，表示該流體觸變性越好[19]，組織黏彈性越好，組織結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。從圖4B可以看出，葵花籽油DAG酸奶觸變環(huán)面積明顯高于另外兩組，說明葵花籽油DAG酸奶具有較好的觸變性，凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定?？赡茉蚴强ㄗ延虳AG酸奶中不飽和脂肪酸的存在促進了脂肪球膜與酪蛋白之間相互作用，使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密。

2.5.2 動態(tài)流變性質(zhì)(見圖5、圖6)

圖5 動態(tài)模量隨角頻率變化曲線

圖6 tanδ隨角頻率變化曲線

儲能模量(G′)和損耗模量(G″)在一定程度上分別對應(yīng)體系的彈性和黏性，G′較高時，體系彈性較大，G″較高時，體系黏性較好。由圖5可以看出，酸奶體系的G′和G″均隨角頻率的增加而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，說明增加外在作用力，體系形變越大，而恢復(fù)形變所需能量將增大，表現(xiàn)出明顯的黏彈性。葵花籽油DAG酸奶和乳脂DAG酸奶體系的G′與G″較乳脂酸奶高，說明植物油DAG和乳脂DAG的添加會增加酸奶體系的黏彈性特征?？ㄗ延虳AG酸奶的動態(tài)模量始終高于乳脂DAG酸奶，這與植物油中的脂肪顆粒較動物油更易與酪蛋白粒子之間發(fā)生交聯(lián)有關(guān)，動態(tài)流變測定結(jié)果與靜態(tài)流變結(jié)果一致。

從圖6可以看出，酸奶體系的損耗因子(tanδ)均小于1，說明其彈性性能始終略高于黏性性能，這表現(xiàn)為一種弱凝膠動態(tài)流變學(xué)特征。乳脂DAG酸奶tanδ較大，其乳液體系更趨向于固態(tài)，流動性低。葵花籽油DAG酸奶tanδ一直處于較低狀態(tài)，說明葵花籽油DAG酸奶體系表現(xiàn)出較好的流動性，相對于乳脂DAG酸奶黏性更大。

2.5.3 酸奶質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果(見表5)

表5 酸奶樣品的質(zhì)構(gòu)指標測定結(jié)果

由表5可知，3組酸奶樣品的堅實度、稠度、黏度等受到油脂類型的影響，且與上述油脂的不飽和脂肪酸含量呈正相關(guān)，葵花籽油DAG酸奶的堅實度和稠度最高，說明其發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度高。黏度由高到低依次為葵花籽油DAG酸奶>乳脂DAG酸奶>乳脂酸奶，與流變測定結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

研究表明，獲得葵花籽油DAG最佳酶解制備工藝條件為：甘油與葵花籽油質(zhì)量比1∶10，酶添加量7.13%，反應(yīng)時間12.35 h。在最佳條件下，酶解反應(yīng)制備葵花籽油DAG中DAG含量可達49.21%，亞油酸含量為60.17%?？ㄗ延虳AG替代乳脂可增加酸奶的不飽和脂肪酸含量，改善酸奶的黏彈性和質(zhì)構(gòu)特性，為其在食品中的應(yīng)用及新型酸奶產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。