于曉銳,劉云,羅旭璐,李麗萍,張加研,趙平*

(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國主要速生用材樹種，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、材性好、用途廣泛等特性。由于無性繁殖具有保持親本優(yōu)良特性、林分整齊和便于育林的優(yōu)點(diǎn)，杉木無性系選育已成為杉木造林種苗品質(zhì)改良的重要途徑，極大地推動(dòng)了杉木人工林的建設(shè)[1-2]。杉木富含杉木精油，其精油的主要成分有柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯、龍腦等[3]，具有抗螨除菌、抗白蟻等功效[4-5]。有關(guān)杉木主要成分的研究，多圍繞其心材、枝干、根等部位的提取方法展開[6-7]。李文珠等[6]采用不同提取工藝對(duì)杉木去皮碎料精油的提取差異性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同提取工藝精油得率差異明顯，排序?yàn)楦绅s法>直接蒸汽蒸餾法>常壓水中蒸餾法>減壓蒸餾法。仲利濤等[7]利用超臨界流體CO2萃取法對(duì)杉木心材精油的提取條件進(jìn)行了探究，獲得了超臨界CO2流體萃取法的最優(yōu)提取工藝。水蒸氣蒸餾法與超臨界CO2流體萃取法相比較，水蒸氣蒸餾法操作成本較低，但超臨界CO2流體萃取法具有工藝流程簡(jiǎn)單、萃取效率高、無有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，然而圍繞不同無性系杉木揮發(fā)性成分的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。

近年來，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)已被廣泛應(yīng)用于植物揮發(fā)性成分的分析[10-13]。吳青思等[10]從構(gòu)造特征和揮發(fā)性成分的角度對(duì)交趾黃檀(Dalbergiacochinchinensis)和微凹黃檀(D.retusa)木進(jìn)行了辨析。付宇新等[11]對(duì)不同化學(xué)類型的樟樹(Cinnamomumcamphora)葉揮發(fā)油成分進(jìn)行了GC-MS聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)不同化學(xué)類型樟樹葉揮發(fā)性成分的組成及含量存在差異。

筆者以浙江省開化縣采集的開化3號(hào)、開化13號(hào)、F24x那1-1和大壩8等4個(gè)無性系杉木葉為研究對(duì)象，分別采用水蒸氣蒸餾和超臨界CO2流體萃取法對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行提取，運(yùn)用GC-MS法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，以期闡明各無性系杉木葉揮發(fā)油化學(xué)成分組成特點(diǎn)，并對(duì)4個(gè)無性系杉木葉揮發(fā)油提取率、化學(xué)成分組成和含量的差異進(jìn)行比較，為杉木葉資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1998年種植的4個(gè)無性系杉木(開化3號(hào)、開化13號(hào)、F24x那1-1、大壩8)葉，于2017年11月采集于浙江省開化縣國有林場(chǎng)，并記錄各無性系杉木的樹高和胸徑信息。各無性系葉樣品經(jīng)陰干、粉碎、過3號(hào)篩(孔徑為0.355 mm)處理后備用。無水乙醇、乙醚、正己烷等購自廣東光華科技股份有限公司，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安永歷制藥機(jī)械有限公司)，BSA224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，水蒸氣蒸餾裝置和SPE-EDTMSFE-2型CO2超臨界流體萃取裝置(美國應(yīng)用分離公司)，Agilent7890B型氣相色譜儀、5977MSD檢測(cè)器(美國安捷倫科技公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)油提取

水蒸氣蒸餾法：稱取各無性系杉木葉粉末約300.00 g置于圓底燒瓶中，加蒸餾水2 L至完全浸沒樣品，加熱提取至回流管內(nèi)揮發(fā)油體積不再增加后，用適量乙醚抽提，乙醚溶液室溫下?lián)]發(fā)至無醚味，0.45 μm濾頭過濾，置于4 ℃冰箱遮光保存?zhèn)溆?。取各揮發(fā)油樣品用正己烷溶解，0.45 μm濾頭過濾，進(jìn)樣分析。

超臨界CO2流體萃取法：稱取各無性系杉木葉粉末約100.00 g，置于超臨界CO2流體萃取儀反應(yīng)釜中，在壓力30 MPa、溫度50 ℃條件下提取120 min，收集樣品溶液后用含水正己烷萃取，減壓濃縮干燥后稱質(zhì)量，置于4 ℃冰箱遮光保存。取各萃取物樣品用正己烷溶解，0.45 μm濾頭過濾，進(jìn)樣分析。

1.3.2 GC-MS分析

GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣為高純氦氣，恒流，柱流速1.0 mL/min；柱溫起始溫度50 ℃(保留2 min)，以5 ℃/min升至220 ℃(保留10 min)。

MS條件：離子源為EI，離子化電壓70 V，檢測(cè)器電壓0.9 kV，發(fā)射電流60 A，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃；掃描范圍15～500 u，溶劑延遲 2.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GC-MS聯(lián)用儀分析得出的總離子流圖以及使用NIST MS數(shù)據(jù)庫對(duì)匹配度達(dá)到90%及以上的揮發(fā)性成分進(jìn)行譜庫檢索并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析。使用峰面積歸一化法對(duì)揮發(fā)性成分相對(duì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行計(jì)算：

相對(duì)含量=(檢出物質(zhì)峰面積/出峰總面積)×

100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方式下杉木葉揮發(fā)油提取率

采用水蒸氣蒸餾和超臨界CO2流體萃取法分別提取各無性系杉木葉中的揮發(fā)油，提取率如表1所示。從表1可以看出，水蒸氣蒸餾法的平均提取率為0.05%～0.11%，超臨界CO2流體萃取法的平均提取率為0.30%～0.52%。結(jié)果表明，超臨界CO2流體萃取法的提取效果顯著高于水蒸氣蒸餾法。在4個(gè)無性系樣品中，開化13號(hào)葉的精油提取率明顯高于其他3個(gè)無性系，推測(cè)可能是由于各無性系之間的遺傳差異所致。

表1 杉木葉揮發(fā)油提取率Table 1 Extraction rates of volatile oils from the Chinese fir leaves

2.2 不同提取方式下杉木葉揮發(fā)性成分組成差異分析

水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2流體萃取法所得4個(gè)無性系杉木葉精油的總離子圖如圖1所示。由圖1可以看出，樣品檢測(cè)基線平穩(wěn)，檢測(cè)方法穩(wěn)定，檢測(cè)出峰分離度好，信噪比在合理范圍，符合揮發(fā)性成分的檢測(cè)要求，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從揮發(fā)性成分總離子流信號(hào)可以看出，超臨界CO2流體萃取法對(duì)樣品中極性部分(保留時(shí)間20～28 min)的提取效果優(yōu)于水蒸氣蒸餾法，通過譜庫匹配和查閱文獻(xiàn)，獲得了各無性系杉木葉揮發(fā)性成分的主要組成及相對(duì)含量[因版面限制，具體數(shù)據(jù)參見開放科學(xué)計(jì)劃(OSID)附表1]，發(fā)現(xiàn)4個(gè)無性系揮發(fā)性成分的組成較為相似，但在含量上存在差異。

圖1 4個(gè)無性系杉木葉揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 The volatile components total ion chromatography of four Chinese fir clone leaves

2.2.1 水蒸氣蒸餾法

采用水蒸氣蒸餾法，從4個(gè)無性系杉木葉中共鑒定了75種揮發(fā)性成分，其中相對(duì)含量在1.00%以上的揮發(fā)性成分共有26種，包括烯烴類17種、醇類6種、酮類1種和其他類型2種，4個(gè)無性系杉木葉中的共有成分為41種。

從開化3號(hào)中共鑒定出揮發(fā)性成分52種，相對(duì)含量在1.00%以上的有15種，占總揮發(fā)性成分的58.79%。其中，β-月桂烯相對(duì)含量高達(dá)14.89%，β-桉葉烯7.10%，α-桉葉烯6.03%，香芹酮6.03%；其余11種成分的相對(duì)含量介于1.07%～3.26%。

從大壩8中共鑒定出揮發(fā)性成分59種，相對(duì)含量在1.00% 以上的有14種，占總揮發(fā)性成分的 83.08%。其中，10.00%以上的有3種，包括β-可巴烯19.95%，α-蒎烯14.03%和β-欖香烯12.14%；β-桉葉烯、α-桉葉烯和β-石竹烯3種成分的相對(duì)含量在5.00%以上；其余8種成分相對(duì)含量在1.01%～3.11%之間。

從開化13號(hào)中共鑒定出揮發(fā)性成分60種，相對(duì)含量在 1.00% 以上的有16種，占總揮發(fā)性成分的 87.21%。其中，10.00%以上的成分及相對(duì)含量有：α-蒎烯17.78%、β-可巴烯15.23%和d-檸檬烯14.48%；其余13種在6.00%以下。

從F24x那1-1中共鑒定出揮發(fā)性成分54種，相對(duì)含量在1.00%以上的有10種，占總揮發(fā)性成分的77.98%。其中，β-石竹烯的相對(duì)含量高達(dá)21.21%，在4個(gè)無性系中占比最高；β-欖香烯、β-桉葉烯、α-桉葉烯和α-蒎烯的占比在8.00%以上；其余成分均在2.00%以下。

β-月桂烯是一種天然存在于多種食物中的調(diào)味物質(zhì)[14]，小鼠試驗(yàn)表明β-月桂烯可保護(hù)全腦缺血再灌注后心肌組織的氧化損傷和組織學(xué)損傷，可作為缺血性卒中后心肌組織安全的替代治療方法[15]。與α-蒎烯、3-蒈烯和d-檸檬烯相比較，β-月桂烯對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNFα)誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)活性的抑制作用最強(qiáng)[16]。

2.2.2 超臨界CO2流體萃取法

采用超臨界CO2流體萃取法提取，從4個(gè)無性系杉木葉中共鑒定了揮發(fā)性成分75種，相對(duì)含量在1.00%以上的揮發(fā)性成分共16種，包括烯烴類10種、醇類4種和其他2種，4個(gè)無性系共有成分24種(附表1，見OSID)。

從開化3號(hào)中共鑒定出揮發(fā)性成分51種，相對(duì)含量在1.00% 以上的有14種，總揮發(fā)性成分的61.81%。其中，5.00%以上的有β-可巴烯10.04%、β-欖香烯9.25%、β-桉葉烯8.89%、β-石竹烯8.28%和α-桉葉烯6.92%；5.00%以下的有9種。

從大壩8中共鑒定出揮發(fā)性成分49種，相對(duì)含量在1.00% 以上的有12種，占總揮發(fā)性成分的59.73%。其中，β-可巴烯相對(duì)含量高達(dá)15.59%，其次為β-欖香烯14.75%，β-桉葉烯和β-石竹烯介于5.00%～10.00%；5.00%以下的有8種。

從開化13號(hào)中共鑒定出揮發(fā)性成分51種，相對(duì)含量在1.00% 以上的有14種，占總揮發(fā)性成分的62.48%。其中，β-可巴烯的含量達(dá)14.47%，與大壩8、開化3號(hào)相一致，占比最高。α-蒎烯、β-欖香烯、d-檸檬烯和β-石竹烯占比在5.00%～7.00%，相對(duì)含量5.00% 以下的有9種。

從F24x那1-1中共鑒定出揮發(fā)性成分40種，相對(duì)含量在1.00%以上的有8種，占總揮發(fā)性成分的61.27%。其中，10.00%以上的成分及相對(duì)含量有β-石竹烯16.42%、β-欖香烯13.27%、β-桉葉烯12.84%和α-桉葉烯10.00%，相對(duì)含量在1.00%～4.00%的有4種。

除無性系F24x那1-1外，其余3個(gè)無性系中β-可巴烯的相對(duì)含量均最高。β-可巴烯具有抗氧化能力，在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域具有減輕氧化損傷的作用[17]，且在人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中不具有基因毒性[18]。無性系F24x那1-1在2種提取方式下，β-石竹烯相對(duì)含量均最高，β-石竹烯可通過抗牙周病原菌改善牙周健康，還具有一定抗炎活性[19-20]。

2.3 不同提取方式下?lián)]發(fā)性成分種類差異分析

水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法所得的4個(gè)無性系杉木葉揮發(fā)性成分的種類差異分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，水蒸氣蒸餾法所得各無性系杉木葉揮發(fā)性成分如下：開化3號(hào)包括烯烴類34種(相對(duì)含量49.46%)、醇類13種(11.78%)、酮類1種(6.03%)和其他類型4種(0.80%)；大壩8包括烯烴類41種(83.96%)、醇類14種(5.45%)和其他類型4種(0.62%)；開化13號(hào)包括烯烴類39種(80.27%)、醇類14種(13.32%)、酮類2種(0.06%)和其他類型5種(0.74%)；F24x那1-1包括烯烴類32種(81.00%)、醇類13種(3.18%)、酮類2種(0.02%)和其他類型7種(3.92%)。4個(gè)無性系杉木葉中均以烯烴類居多，醇類次之，共有成分有41種，且不同無性系的揮發(fā)性成分相對(duì)含量和種類差異顯著。開化3號(hào)中烯烴類的相對(duì)含量與其他3個(gè)無性系存在較大差異，可能與開化3號(hào)樣品檢測(cè)基線不太穩(wěn)定有關(guān)(圖1)。

超臨界CO2流體萃取法所得各無性系杉木葉揮發(fā)性成分如下：開化3號(hào)包括烯烴類32種(58.73%)、醇類13種(8.01%)、酮類1種(0.02%)和其他類型5種(2.66%)；大壩8包括烯烴類25種(58.22%)、醇類13種(5.91%)、酮類3種(0.21%)和其他類型9種(2.19%)；開化13號(hào)包括烯烴類31種(59.43%)、醇類12種(9.19%)、酮類3種(0.23%)和其他類型5種(2.07%)；F24x那1-1包括烯烴類20種(59.06%)、醇類10種(3.19%)和其他類型10種(6.71%)。4個(gè)無性系杉木葉中均以烯烴類占比最多，共有成分有24種，其他類含量相差較小，成分種類差異不大。

圖2 4個(gè)無性系杉木葉揮發(fā)性成分分類Fig. 2 Classification of volatile components of the leaves in four Chinese fir clones

3 結(jié) 論

采用2種不同的提取方式對(duì)浙江省開化縣的4個(gè)無性系杉木葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)所得提取物進(jìn)行分析，結(jié)合試驗(yàn)和分析結(jié)果進(jìn)行不同方法同種無性系、同種方法不同無性系的對(duì)比分析，結(jié)論如下：

1)2種提取方法中水蒸氣蒸餾法提取成分極性較小，而超臨界CO2流體萃取法提取效率更高。所提取的揮發(fā)性成分包括烯烴類、醇類、酮類以及其他類物質(zhì)，2種提取方式提取揮發(fā)性成分相對(duì)含量在10%以上均為烯烴類，是杉木特殊香氣的主要成分。

2)水蒸氣蒸餾法檢出的4個(gè)無性系杉木葉的揮發(fā)性主要成分有β-月桂烯、α-蒎烯、β-欖香烯、β-可巴烯、d-檸檬烯、β-石竹烯、α-桉葉烯和β-桉葉烯，其中F24x那1-1中β-石竹烯的相對(duì)含量高達(dá)21.21%。超臨界CO2流體萃取法檢出的4個(gè)無性系杉木葉的揮發(fā)性主要成分有β-可巴烯、β-欖香烯、β-石竹烯、α-桉葉烯和β-桉葉烯。結(jié)合主成分分析，可以看出4個(gè)無性系間揮發(fā)性成分是相似的，但不同提取方式所提取的揮發(fā)性成分的相對(duì)含量存在差異。