劉樂樂, 方亦午, 劉 曦, 陳先鋒, 邊 勇, 顧建鋒

(1.寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司，浙江 寧波 315100；2.寧波海關技術中心/寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 寧波 315100；3.北京市林業(yè)保護站，北京 100029；4.北京海關技術中心，北京 101300)

傘滑刃線蟲屬(Bursaphelenchus)是1937年由Fuchs[1]提出并建立，目前已報道的有效種多達120種，該屬線蟲主要習居于樹木中，大多靠取食真菌為生.其中，松材線蟲[B.xylophilus(Steiner & Buhrer,1934) Nickle, 1970]和椰子紅環(huán)腐線蟲[B.cocophilus(Cobb, 1919) Baujard, 1989]具有較強的致病性，且是國際重要檢疫對象[2].

在我國，松材線蟲于1982年在南京中山陵的黑松上首次被發(fā)現(xiàn)[3]，之后逐步擴散.據(jù)國家林業(yè)和草原局2019年第4號公告，我國松材線蟲疫區(qū)已達18個省588個縣級行政區(qū)，病死松樹超過1 000萬株.目前，該蟲向北已擴散到遼寧省鐵嶺市，紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)和落葉松(LarixolgensisHenry)為新確認的松材線蟲自然感病寄主[4-5].

2019年初，北京市林業(yè)保護站在對北京市周邊林區(qū)的松材線蟲進行普查時，發(fā)現(xiàn)一株油松(PinustabulaeformisCarrière, 1867)有枯萎病癥，取病木樣送至北京海關技術中心進行分離，獲得大量的傘滑刃屬線蟲，最后寧波海關技術中心將其鑒定為東京傘滑刃線蟲(BursaphelenchustokyoensisKanzaki, 2009).

據(jù)報道，東京傘滑刃線蟲僅在日本東京的赤松(PinusdensifloraSieb. & Zucc., 1842)[6]和我國廣東珠海的黑松(PinusthunbergiiParl.)[7]上有分布，此次為我國華北地區(qū)的首次報道.本文對該北京油松線蟲群體的形態(tài)和分子生物學特征進行描述，以期為今后該線蟲的鑒定提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

帶有線蟲的樹枝樣品采集于北京市郊的油松上，將其帶回實驗室，用斧頭劈成細小片段.采用改良貝曼漏斗法[8]分離線蟲，先向漏斗中注入適量自來水(以能恰好浸沒樣品為宜)，于25 ℃左右靜置24 h后，用凹面皿接取線蟲懸浮液10 mL，在體視顯微鏡下檢查.

1.2 形態(tài)學鑒定

將分離出來的雄蟲和雌蟲殺死固定后，采用甘油—乙醇快速脫水法脫水[9]，然后挑入甘油滴中，用石蠟封片，制作成永久玻片.用Zeiss Imager Z1自動顯微鏡和Zeiss Axio Cam MRm數(shù)碼相機觀察形態(tài)并拍照，采用de Man公式對線蟲進行測計[10].

1.3 分子生物學鑒定

單條線蟲的DNA提取方法參見文獻[11].rDNA 18S基因片段擴增引物及程序參照文獻[12]，rDNA 28S基因片段擴增引物及程序參照文獻[13]，rDNA ITS基因片段擴增引物及程序參照文獻[14-15]，擴增引物和退火溫度見表1.將PCR產(chǎn)物分離純化后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序.

表1 本研究所用的引物序列和退火溫度

用MEGA 6.0軟件拼接測序所得序列，將拼接后的序列提交至GenBank獲得登錄號，并從GenBank下載相關線蟲的序列進行比對分析，然后用MEGA軟件構建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹.

2 結果與分析

2.1 北京油松線蟲群體的形態(tài)特征

從北京油松中分離的傘滑刃線蟲群體雄蟲和雌蟲的形態(tài)測計值見表2.

表2 東京傘滑刃線蟲北京油松群體與原始文獻形態(tài)測計值的比較

續(xù)表2

測計指標雄蟲北京油松群體日本赤松群體[6]雌蟲北京油松群體日本赤松群體[6]中食道球長/μm14.4±1.1(12.3～16.5)14.5±0.6(13.5～15.0)15.7±1.3(13.9～18.8)15.0±0.9(14.0～16.5)中食道球長寬比1.5±0.1(1.3～1.6)1.43±0.1(1.35～1.50)1.4±0.2(1.0～1.6)1.41±0.1(1.27～1.60)頭前端到排泄孔長/μm59.3±5.0(51.6～67.5)63±5.6(58～72)61.3±6.7(48.4～73.8)61±4.4(58～71)精巢或卵巢長/μm391.2±71.5(257.0～528.2)400±67(285～466)347.0±82.0(207.0～481.1)382±66(275～479)后陰子宮囊長度/μm-106.4±9.5(90.2～125.2)116±10(103～140)陰門到肛門距離/μm-140.2±16.4(115.3～168.8)后陰子宮囊長/陰門到肛門距離/%-76.3±6.0(65.6～89.3)74.5±3.7(68.0～81.3)肛門處體寬/μm10.8±1.0(9.2～12.3)12.0±0.5(11.0～12.5)9.6±1.0(7.4～11.3)10.0±0.7(9.5～11.5)尾長/μm25.3±2.5(21.8～30.2)27±1.3(25～29)22.6±2.8(18.0～30.1)21±1.9(18～25)尾尖突長/μm-1.2±0.4(0.5～2.1)交合刺中弧線長/μm14.0±1.3(11.3～15.8)15.5±0.3(15.0～16.0)-交合刺直線長/μm14.2±1.4(10.5～16.5)15.0±0.5(14.5～16.0)-頭前端至半月體長/μm82.8±4.6(73.6～89.8)88±4.1(82～92)82.9±5.1(71.0～91.0)90±4.7(81～100)排泄孔至半月體長/μm23.5±3.5(18.9～31.0)21.6±5.5(13.3～34.3)

雄蟲：蟲體圓柱形、細長，體前部漸細，熱殺死后蟲體向腹面彎曲呈“J”形(圖1A)，體表環(huán)紋明顯，側區(qū)有4條側線(圖1I).唇區(qū)縊縮明顯，唇寬約為唇高的2倍(圖1C).口針纖細，口針長9.4～12.2 μm，針錐長4.0～6.5 μm，約占口針總長度的44%，口針基部略增厚(圖1C).中食道球卵圓形，后食道腺長，從背側覆蓋腸(圖1B).排泄孔位置多變，一般位于中食道球對應處至中食道球后1個中食道球長度之間，半月體位于排泄孔后13.3～34.3 μm，一般位于神經(jīng)環(huán)后.單精巢前伸，精巢有時回折；精母細胞在精巢前端1/3處多行排列，在精巢中部單行排列并形成大的精子，后部精子多行排列直至精巢末端.尾乳突7個：單個乳突(P1)恰好位于泄殖腔前腹中部，第1對亞腹乳突(P2)位于泄殖腔前，較P1略靠后或幾乎平行，第2對亞腹乳突(P3)和第3對腹部乳突(P4)彼此接近，與P2相距約一個肛門處體寬.交合刺呈爪狀，基頂小、方形、不顯著；喙突小、鈍尖；冠狀體平整，在中部略凹陷；交合刺內(nèi)緣和外緣光滑，無刻痕，逐漸變細，末端鈍或略方，無盤狀突(圖1E-G).尾部短，向腹部強烈彎曲，約為肛門處體寬的2倍(圖1E-G).交合傘卵圓形，末端鈍尖(圖1H).

雌蟲：熱殺死后蟲體向腹面彎曲，在陰門處彎曲更加明顯.體前部、食道等結構與雄蟲相似.單卵巢前伸；卵母細胞在卵巢前端1/3處單行排列，在卵巢中部呈2～3行排列，在卵巢后部發(fā)育成單行成熟的卵細胞(圖2A).陰門處具有一小陰門蓋(圖2B)；后陰子宮囊很長，為陰門處體寬的6～8倍，約為肛陰距的76.3%，有時充滿精子(圖2A).肛門小，腹面觀為一橫裂.尾部短、近圓柱形，末端較寬，具有或尖或鈍的短尾尖突，長0.5～2.1 μm(圖2C-G).

東京傘滑刃線蟲北京油松群體形態(tài)特征與Kanzaki et al[6]描述的日本赤松群體基本吻合.

2.2 與近似種的比較

根據(jù)4條側線，雄蟲交合刺似爪狀、基頂不明顯、喙突鈍尖、無盤狀突，雄蟲尾突排列及數(shù)量，雌蟲具小陰門蓋、尾短、末端寬圓且有或鈍或尖的尾尖突等特征，發(fā)現(xiàn)東京傘滑刃線蟲北京油松群體與云杉傘滑刃線蟲(B.piceaeTomalak & Pomorski, 2015)[16]、椴樹傘滑刃線蟲(B.tiliaeTomalak & Malewski, 2014)[17]、歐洲山毛櫸傘滑刃線蟲(B.fagiTomalak & Filipiak, 2014)[18]、指小傘滑刃線蟲(B.idiusWalter Rühm, 1956)[19]十分相似.

東京傘滑刃線蟲與云杉傘滑刃線蟲的主要區(qū)別是交合刺形態(tài)，前者逐漸變細，而后者交合刺整體較粗，至交合刺末端才變細[16].

東京傘滑刃線蟲與椴樹傘滑刃線蟲的主要區(qū)別：前者交合刺無盤狀突，而后者有盤狀突；交合刺中弧線長14.0(11.3～15.8) μm vs 20.0(18.1～21.8) μm；雄蟲肛門處體寬10.8(9.2～12.3) μm vs 6.5(6.2～7.0) μm[17].

東京傘滑刃線蟲與歐洲山毛櫸傘滑刃線蟲的主要區(qū)別：前者排泄孔位于中食道球對應處至中食道球后1個中食道球長度之間，后者位于中食道球對應處或略靠前； 前者交合刺逐漸變細，中部略粗，而后者急劇變細，中部略細；雄蟲體長/最大體寬的值為41.6(33.0～55.9)vs 64.5(56.5～73.8)，雌蟲體長/最大體寬的值為37.4(30.2～43.3)vs 56.8(50.4～67.1)[18].

A.雄蟲整體；B-D.體前部；E-G.尾部及交合刺；H.交合傘；I.側線區(qū).P1-P4.尾乳突.比例尺=10 μm.

圖1 東京傘滑刃線蟲北京油松群體的雄蟲形態(tài)

Fig.1 Morphological characteristics of maleB.tokyoensis

A.后陰子宮囊；B.陰道、陰門；C-G.尾部.比例尺=10 μm.

圖2 東京傘滑刃線蟲北京油松群體的雌蟲形態(tài)

Fig.2 Morphological characteristics of femaleB.tokyoensis

東京傘滑刃線蟲與指小傘滑刃線蟲的區(qū)別在于側線數(shù)(4條vs 6條)和尾乳突位置(P2位于P1后，P3和P4靠近vs P2位于P1前，P3和P4分開)[19].

2.3 分子生物學特征

通過對北京油松線蟲群體的rDNA擴增測序，共獲得4條完全一致的長1 717 bp的18S序列，GenBank登錄號為MK116557-MK116560，與日本赤松群體(登錄號：AB430445)的相似度為99%.獲得2條完全一致的長752 bp的28S-D2/D3序列，GenBank登錄號分別為MK116561、MK116562，與日本赤松群體(登錄號：AB430446)的相似度為99%.獲得4條長948 bp的ITS序列，GenBank登錄號為MK116563-MK116566，其中MK116563與MK116565的序列完全一致，且與MK116564序列有一個堿基的差異，與MK116566序列有4個堿基的差異，與日本赤松群體(登錄號：AB430445)和廣東珠海黑松群體(登錄號：KY646465)的相似度分別為98%和97%.

基于rDNA 18S、28S和ITS基因序列構建了系統(tǒng)進化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)北京油松群體均與日本赤松群體聚在一個分支上，相比與廣東珠海黑松群體，北京油松群體與日本赤松群體的親緣關系更接近.

綜合形態(tài)特征和分子生物學特征，最終將該北京油松線蟲群體鑒定為東京傘滑刃線蟲.

3 討論

結合文獻報道[6-7]及本次調(diào)查可知，東京傘滑刃線蟲的寄主比較廣泛，赤松、黑松、油松均能被其侵染.

北京油松群體、日本赤松群體和廣東珠海黑松群體形態(tài)特征基本一致，北京群體和日本群體測計值基本吻合，但是與廣東群體存在較大的差異.廣東群體雄蟲體長/尾長的值為28.7～42.8，大于日本群體(24.4～29.0)和北京群體(22.0～28.2)；泄殖腔口至精巢末端距離×100/體長的值為28.4～48.9，小于日本群體(43.0～65.7)和北京群體(46.7～72.0)；肛寬5.8～8.8 μm，明顯小于日本群體(11.0～12.5 μm)和北京群體(9.2～12.3 μm)；精巢長177.5～282.1 μm，明顯小于日本群體(285～466 μm)和北京群體(257.0～528.2 μm)；尾長12.6～19.8 μm，明顯小于日本群體(25～29 μm)和北京群體(21.8～30.2 μm).廣東群體雌蟲體前端至陰門的距離×100/體長的值為29.5～43.5，明顯小于日本群體(75.5～79.1)和北京群體(75.1～79.1).此外，北京群體體長和體寬均略小于日本群體，這可能與日本群體測計的樣本量較小或者地域不同有關系.

本研究在GenBank中提交的4條rDNA-ITS序列分別來自于同一寄主上的4條東京傘滑刃線蟲，但這4條序列并不完全一致，說明來源于同一地域、同一寄主的東京傘滑刃線蟲群體的rDNA-ITS序列存在種內(nèi)變異，這為該線蟲的鑒定增加了難度.

根據(jù)4條側線，雄蟲交合刺似爪狀、基頂不明顯、喙突鈍尖，雌蟲具小陰門蓋、后陰子宮囊長約為肛陰距的3/4等特征，建議將東京傘滑刃線蟲和云杉傘滑刃線蟲、椴樹傘滑刃線蟲、歐洲山毛櫸傘滑刃線蟲、指小傘滑刃線蟲歸為一個組，稱東京傘滑刃線蟲組.基于ITS基因序列構建的系統(tǒng)進化樹也支持該分組結論.另外，東京傘滑刃線蟲日本赤松群體、廣東珠海黑松群體和本研究中北京油松群體都是從枯死的松樹上分離獲得，對于此線蟲能否致病，是否是導致松樹死亡的原因，仍有待進一步研究.