景曉莉

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大等原因，胃癌漸呈年輕化趨勢(shì)[1]。胃癌早期癥狀不顯著，易被錯(cuò)誤認(rèn)為胃炎、胃潰瘍等疾病，貽誤最佳治療時(shí)期[2]。當(dāng)前胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不完全明了，遠(yuǎn)期預(yù)后往往不佳，因此尋求評(píng)估胃癌進(jìn)展與預(yù)后的新指標(biāo)對(duì)胃癌的免疫治療具有重要臨床價(jià)值。近年來(lái)，細(xì)胞衰老作為根治惡性腫瘤的靶標(biāo)已受到廣泛關(guān)注，研究表明，Cbx4可通過(guò)抑制細(xì)胞衰老促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展[3]，但Cbx4在胃癌中筆者未見(jiàn)研究。FRMD4A包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域，包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域的蛋白與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，然而FRMD4A在胃癌中研究較少。本研究通過(guò)觀察胃癌組織及其癌旁組織Cbx4、FRMD4A表達(dá)差異，探討Cbx4、FRMD4A與臨床病理關(guān)系及其預(yù)后的關(guān)系，以期為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月至2016年4月于我院進(jìn)行手術(shù)治療的85例胃癌患者胃癌組織標(biāo)本作為胃癌組，另選取距癌組織邊緣>5 cm的對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本為癌旁組織組?；颊呔?jīng)病理證實(shí)為胃癌。其中男52例，女33例；年齡41～75歲，平均年齡(56.21±4.92)歲。收集臨床病理資料，包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織分化程度、浸潤(rùn)深度等。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)；②術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及激素治療者；③病灶無(wú)明顯壞死區(qū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性疾病者；②具有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)癌旁組織；③合并其他惡性腫瘤者；④臨床資料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantification PCR，qRT-PCR)檢測(cè)Cbx4、FRMD4A mRNA表達(dá):采用qRT-PCR法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A mRNA 相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用TRI試劑提取胃癌組織及其癌旁組織標(biāo)本RNA，通過(guò)Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系共為50 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，內(nèi)參照上游引物下游引物各0.5 μl，dNTP 0.5 μl Taq酶1 μl，待測(cè)樣本cDNA 5 μl，ddH2O 32.5 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，引物通過(guò)生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)。Cbx4、FRMD4A均以GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt算法[7]計(jì)算Cbx4、FRMD4A mRNA相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)Cbx4、FRMD4A蛋白表達(dá):嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，采用蘇木素復(fù)染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。2位具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師做雙盲閱片，以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，在200倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個(gè)切片中選取10個(gè)高倍視野中隨機(jī)挑選并對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用IP評(píng)分進(jìn)行結(jié)果判讀：①染色強(qiáng)度，細(xì)胞無(wú)染色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，染色細(xì)胞數(shù)<10% 0分；染色細(xì)胞數(shù)10%～30% 1分；染色細(xì)胞數(shù) 31%～60% 2分；染色細(xì)胞數(shù)>60% 3分。兩項(xiàng)計(jì)分結(jié)果相乘，>2分為陽(yáng)性，<2分為陰性。

1.3.3 隨訪：患者出院后通過(guò)電話、郵件及上門隨訪方法觀察生存情況，終止日期為2019年4月。

2 結(jié)果

2.1 Cbx4、FRMD4A mRNA表達(dá)情況 與癌旁組織相比，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別Cbx4/GAPDHFRMD4A/GAPDH癌旁組1.01±0.200.64±0.15胃癌組1.37±0.231.22±0.21t值10.88920.721P值<0.001<0.001

2.2 胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A蛋白表達(dá)情況 鏡下觀察，Cbx4定位于細(xì)胞核與細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒狀。FRMD4A陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。與癌旁組相比，胃癌組Cbx4、FRMD4A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均升高(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖1。

2.3 Cbx4、FRMD4A蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Cbx4、FRMD4A表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小差異均無(wú)關(guān)(P>0.05)；Cbx4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。FRMD4A蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 2組Cbx4、FRMD4A蛋白表達(dá)情況 n=85

圖1 Cbx4、FRMD4A蛋白表達(dá)情況(SP×200);A 癌旁組織Cbx4蛋白陰性表達(dá)；B 胃癌組織Cbx4蛋白陽(yáng)性表達(dá)；C 癌旁組織FRMD4A弱陽(yáng)性表達(dá)；D 胃癌組織FRMD4A陽(yáng)性表達(dá)

2.4 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示，Cbx4陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存率顯著低于Cbx4陰性表達(dá)者(27.5% vs 76.5%，P<0.05)，F(xiàn)RMD4A陽(yáng)性表達(dá)者的總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達(dá)者(23.4% vs 76.3%，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5 胃癌預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 單因素COX分析顯示，性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、Cbx4、FRMD4A均是影響胃癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素COX分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸潤(rùn)深度T3～ T4、Cbx4陽(yáng)性表達(dá)、FRMD4A陽(yáng)性表達(dá)是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=1.575，2.491，1.575，3.709，3.691，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 Cbx4、FRMD4A表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)各種惡性腫瘤中胃癌發(fā)病率居首位，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，患者趨于年輕化。Cbx4屬于PcG家族成員，有研究表明Cbx4在大腸癌、肝癌癌組織中高表達(dá)[5-7]，但在胃癌中則較少。FRMD4A是近年來(lái)被克隆鑒定的新基因，F(xiàn)RMD4A基因表達(dá)產(chǎn)物FRMD4A蛋白是一類擁有FRMD結(jié)構(gòu)域的蛋白，F(xiàn)RMD結(jié)構(gòu)域具有調(diào)控細(xì)胞骨架，參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的功能[8]。FRMD4A在鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，但在胃癌中研究較少。

圖2 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系；左為Cbx4表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系；右為FRMD4A表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

表5 胃癌患者預(yù)后影響因素分析

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞周期無(wú)法進(jìn)入S期啟動(dòng)染色質(zhì)復(fù)制完成增殖活動(dòng)的過(guò)程，衰老細(xì)胞可被免疫細(xì)胞清除，是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的天然屏障[9]。多梳家族蛋白(polycomb group，PcG)表達(dá)失調(diào)可造成多種惡性腫瘤，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老[10,11]。Cbx4基因是一個(gè)特殊的PcG蛋白，定位于17號(hào)染色體17q25.3，屬于PRC1復(fù)合物組分之一，而PRC1是PcG蛋白的主要成分之一[12]。Li等[13]研究表明，Cbx4可通過(guò)提高HIF-1α表達(dá)，增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，并促進(jìn)血管生成，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Zeng等[14]研究表明，Cbx4可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究中，胃癌組織中Cbx4 mRNA表達(dá)顯著高于其癌旁組織，免疫組化法結(jié)果顯示胃癌組Cbx4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織組，提示Cbx4在胃癌組織中高表達(dá)，可能與胃癌的發(fā)生具有一定關(guān)系。進(jìn)一步分析顯示，Cbx4蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、病理分期、分化程度等密切相關(guān)。另外，Cbx4陽(yáng)性表達(dá)者3年內(nèi)總生存率顯著低于Cbx4陰性表達(dá)者，提示Cbx4陽(yáng)性表達(dá)可能影響患者生存時(shí)間，不利于胃癌患者預(yù)后。進(jìn)一步研究表明，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤(rùn)深度T3～ T4、分化程度低、Cbx4陽(yáng)性表達(dá)是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示對(duì)于術(shù)后胃癌患者，檢測(cè)Cbx4蛋白表達(dá)水平結(jié)合TNM分期、浸潤(rùn)深度、分化程度可能更準(zhǔn)確地評(píng)估患者預(yù)后，優(yōu)化治療方法。

FRMD4A基因位于人染色體10p13，編碼的FRMD4A蛋白屬于FERM超家族成員，擁有FERM結(jié)構(gòu)域，而含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-17]。目前對(duì)FRMD4A研究較少，通常參考其他具有FERM結(jié)構(gòu)域蛋白的研究進(jìn)行了解。Goldie等[18]研究表明，在人鱗狀細(xì)胞癌中FRMD4A高表達(dá)。本研究胃癌組織中FRMD4A mRNA表達(dá)顯著高于其癌旁組織，免疫組化試驗(yàn)顯示FRMD4A蛋白在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，提示FRMD4A表達(dá)與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。FRMD4A陽(yáng)性表達(dá)率隨TNM分期、浸潤(rùn)深度升高、病理分期升高、向低分化發(fā)展、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)，提示FRMD4A表達(dá)與臨床病理特征密切相關(guān)。生存分析顯示，F(xiàn)RMD4A陽(yáng)性表達(dá)者3年內(nèi)總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達(dá)者，進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)RMD4A陽(yáng)性表達(dá)亦是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，提示檢測(cè)FRMD4A表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后評(píng)估具有一定參考價(jià)值。

綜上所述，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A高表達(dá)，二者與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，檢測(cè)Cbx4、FRMD4A表達(dá)對(duì)預(yù)后判斷等具有一定臨床意義。