范建華，趙華軒，李尚民，蔣一秀，孫常法，姚勤光，竇新紅*

(1.江蘇省家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225003；2.江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225003；3.江蘇康世源藥液有限公司，江蘇新沂 221400)

在畜禽養(yǎng)殖中，垂直傳播疾病一直困擾著我國畜牧業(yè)健康發(fā)展[1]。垂直傳播疾病，除了蛋胚源媒介外，另外一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是公畜禽通過配種(包括人工授精和自然交配)，將精液含有的病原微生物傳給母體，其受孕的過程可能就是病原傳播的過程。在生產(chǎn)實(shí)踐中，曾發(fā)生過多種垂直傳播疾病，如豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、禽流感、禽白血病、雞傳染性貧血等[2,3]，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會(huì)通過種代擴(kuò)繁傳播至下一代[4]，造成更大范圍的感染。

目前解決種畜禽精液中帶菌或帶毒問題的最常見方法是，在精液稀釋過程中適量添加抗生素進(jìn)行消毒。但該方法對病毒的作用微乎其微，并存在因長期應(yīng)用而導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問題，而且還對精液精子活力存在極大的傷害[5-7]。

為此，本研究對新創(chuàng)制開發(fā)的一種中藥精液消毒劑進(jìn)行了體外抑菌殺毒和急性毒性、刺激性，以及臨床應(yīng)用等安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，以期為今后進(jìn)一步研制一種安全高效的中藥精液消毒劑產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)菌(毒)種 實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)菌禽巴氏桿菌C48-1 株、雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株YD2 株、大腸桿菌C15003 株和金黃色葡萄球菌YD-1 株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；選用的新城疫病毒F48E8為揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用的BABC小鼠、新西蘭大白兔和雞胚等均為市購。

1.3 主要儀器設(shè)備 主要儀器設(shè)備包括超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、高效液相色譜儀、電子顯微鏡、中藥混懸液均質(zhì)機(jī)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠具和小型孵化器等。

2 方 法

2.1 中藥精液消毒劑的制備 按成分重量比，取板藍(lán)根、苦楝、地榆、大青葉和蘆薈提取物各1.5%、果糖3.0%、甘油4.0%、檸檬酸鈉2.5%、維生素C 0.3%、余量為去離子水混合，并用檸檬酸鈉調(diào)至PH值7.5±0.2，在37℃、轉(zhuǎn)速為20～25 轉(zhuǎn)/分的條件下低速攪拌30 分鐘混勻，經(jīng)過濾除菌后澄清、透明溶液即為本實(shí)驗(yàn)用中藥消毒劑。

2.2 對病原微生物的殺滅試驗(yàn)

2.2.1 對4種有害菌的體外抑菌試驗(yàn) 采用打洞法[8]開展受試消毒劑對4種致病菌的藥敏試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈直徑>20 mm為極敏，15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏，<10 mm為低敏來判定受試藥物敏感度高低[9]；將受試消毒劑用生理鹽水按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀釋，測定其對4種致病菌的最小抑菌濃度。

2.2.2 對雞新城疫病毒(NDV)的殺滅試驗(yàn)

2.2.2.1 雞新城疫病毒(NDV)的定性殺滅試驗(yàn) 采用雞胚感染法[10]，將受試消毒劑用去離子水稀釋成1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000的梯度濃度下各2.5 mL，在室溫條件下與2×105EID502.5 mL的新城疫病毒分別感作5、15和30 min，接種10 日齡的雞胚，24 h后觀察雞胚死亡情況。

2.2.2.2 雞新城疫病毒(NDV)的定量殺滅試驗(yàn) 將新城疫病毒液稀釋成2×105EID502.5 mL，分別加入三個(gè)不同濃度的消毒劑1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000各2.5 mL，以PBS作為對照組。充分搖勻，置室溫5 min，吸取混合液1 mL加入9 mL硫代硫酸鈉中和劑，作用10 min后，測定各組病毒滴度EID50值。EID50值參照Reed-Muench方法[11]計(jì)算。

2.3 安全性評價(jià)試驗(yàn)

2.3.1 急性毒性試驗(yàn) 選擇體重約20 g的BABC小鼠雌雄各10 只。取原藥液10 mL加去離子水20 ml稀釋作為供試液，按0.1 mL/10 g.BW的劑量一次性經(jīng)口灌胃，最大限度灌胃劑量設(shè)計(jì)5000 mg/kg.BW(按體積重量比折算，5000 mg為灌胃液中含原藥液總重量)，連續(xù)2 周觀察小鼠的采食、飲水及精神狀態(tài)情況，計(jì)算體重變化、中毒死亡只數(shù)。

2.3.2 刺激性試驗(yàn)

2.3.2.1 皮膚刺激性試驗(yàn) 選擇健康無眼部疾病，體重約2.3 kg的新西蘭大白兔3 只。試驗(yàn)前24 h，將兔子背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛范圍3 cm×3 cm，第二天在左側(cè)去毛部位劃出2.5 cm×2.5 cm試驗(yàn)區(qū)，在其上將受試消毒劑原液0.5 mL均勻涂布，并覆蓋2～4層同樣大小的紗布和一層稍大的玻璃紙，再用無刺激的膠布固定，使受試消毒劑與皮膚直接接觸4 h。右側(cè)作為對照。試驗(yàn)結(jié)束后除去覆蓋物，并用溫水洗凈。分別記錄除去覆蓋物后的2 周內(nèi)的皮膚刺激反應(yīng)。

2.3.2.2 眼睛刺激性試驗(yàn) 選擇健康無眼部疾病，體重約2.3 kg的新西蘭大白兔3 只。將動(dòng)物左側(cè)眼瞼輕輕分開，吸取0.1 mL受試消毒劑原液滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)，右側(cè)眼滴入等量的生理鹽水作為對照。滴眼后將上下眼閉合30 s，再用生理鹽水沖洗，除去受試藥品。分別于滴眼后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d和21 d，觀察兔子角膜、虹膜和結(jié)膜刺激反應(yīng)。

2.3.3 精子活力影響試驗(yàn)

2.3.3.1 常溫保存條件下對精子生存指數(shù)影響 將新鮮采集的種公雞精液，在37 ℃水浴條件下，按照1∶2分別加入原液受試消毒劑、10倍原液稀釋受試消毒劑和100倍原液稀釋受試消毒劑，以及生理鹽水對照，然后在20℃條件下，每隔2 h觀察精子的存活情況，最終統(tǒng)計(jì)精子生存指數(shù)。

2.3.3.2 凍融條件下對精子存活率影響 將活力不低于0.7，密度在0.8～1.0×108/ml精子，按照有關(guān)參考文獻(xiàn)方法，分別在原液受試消毒劑、10倍原液稀釋受試消毒劑和100倍原液稀釋受試消毒劑中冷凍再解凍，并設(shè)生理鹽水作為對照，觀察凍后精子的存活率。

2.3.4 對種公雞精液消毒后的次代孵化率和出雛率影響試驗(yàn) 將新鮮采集的種公雞精液，在37℃水浴條件下，按照1∶2分別加入10倍稀釋的受試消毒劑和12%的甘油稀釋，并設(shè)生理鹽水對照。然后按正常生產(chǎn)方式人工授精和收集種蛋，進(jìn)行孵化，分別記錄種蛋受精率和孵化率。取兩次測定結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 對病原微生物的殺滅效果

3.1.1 對4種雞有害菌的殺滅效果 由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，該消毒劑對大腸桿菌的抑菌圈直徑平均為18 mm，屬于高度敏感，對沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑范圍為11～12 mm，均為中度敏感；稀釋16倍后，對禽巴氏桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為62.5 mg/mL，稀釋32倍后，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.3 mg/mL。具體結(jié)果見表1和表2。

3.1.2 對雞新城疫病毒(NDV)的殺滅效果 對NDV的定性殺滅結(jié)果表明，受試消毒劑按1∶400及以上濃度稀釋，最短作用時(shí)間5 min，即對NDV具有良好的殺滅效果，病毒殺滅率為100%，達(dá)到國內(nèi)規(guī)定的消毒劑消毒標(biāo)準(zhǔn)。具體結(jié)果見表3。

對NDV的定量殺滅結(jié)果表明，受試消毒劑按1∶400及以上濃度稀釋，雞胚無死亡，病毒滅活率為100%。具體結(jié)果見表4。

表1 中藥消毒劑藥敏試驗(yàn)測定結(jié)果Tab 1 Results of drug sensitivity test of traditional Chinese medicine disinfectant

表2 中藥消毒劑最小抑菌濃度Tab 2 MIC of traditional Chinese medicine disinfectant

表3 中藥消毒劑對NDV的定性殺滅結(jié)果Tab 3 Qualitative killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

注：*為陽性雞胚數(shù)/試驗(yàn)雞胚數(shù)

Note: * Positive Embryo Count / Test Embryo Count

表4 中藥消毒劑對NDV的定量殺滅結(jié)果Tab 4 Qualified killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

3.2 安全性評價(jià)

3.2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 由表5可知，17 d觀察期內(nèi)，20只受試小鼠體重逐漸增加，未見任何中毒體征和死亡。受試消毒劑經(jīng)口半數(shù)致死量LD50>5000 mg/kg。根據(jù)急性毒性評價(jià)規(guī)定，該消毒劑為無毒級。

表5 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of acute toxicity test in mice

3.2.2 皮膚和眼睛刺激性試驗(yàn)結(jié)果 表6試驗(yàn)結(jié)果表明，受試消毒劑連續(xù)對新西蘭大白兔皮膚涂抹14 d，試驗(yàn)期間未見紅斑和水腫等異常反應(yīng)，刺激指數(shù)為0，對皮膚無刺激。表7試驗(yàn)結(jié)果表明，給藥期間，受試動(dòng)物眼均未出現(xiàn)角膜和虹膜損害以及結(jié)膜水腫或充血現(xiàn)象，眼刺激平均評分為0，也未見全身中毒，對眼睛無刺激。

表6 大白兔的皮膚刺激反應(yīng)評分Tab 6 Skin irritation response scores of white rabbits

表7 大白兔的眼部刺激反應(yīng)評分Tab 7 Eye irritation response scores of white rabbits

3.2.3 對精子活力的影響 由表8可知，常溫保存下，精子中加入受試消毒劑組生存指數(shù)均低于生理鹽水對照組，原液組和100倍稀釋組差異顯著(P<0.05)，但10倍稀釋組差異不顯著(P>0.05)；3個(gè)梯度受試消毒劑組間，10倍稀釋組要顯著高于其它兩組(P<0.05)。由表9可知，在冷凍條件下，受試消毒劑組精子的存活率均顯著高于對照組(P<0.05)，且10倍原液稀釋受試消毒劑組差異極顯著(P<0.01)。

表8 種公雞精液中精子的中生存指數(shù)Tab 8 Median survival index of spermatozoa in semen of breeder cocks

注：肩頭雙字母中有一個(gè)不同，均表示差異顯著(P<0.05)。

Note: There was one difference of double letters in shoulder， which indicated significant difference (P< 0.05).

表9 中藥消毒劑對種公雞精液中精子冷凍保護(hù)效果Tab 9 Cryopreservation effect of traditional Chinese medicine disinfectant to breeder cocks sperm

注：肩頭字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The difference of shoulder letters is significant (P< 0.05).

3.2.4 對雞次代孵化和出雛率的影響 中藥精液消毒劑與精液作用后，對蛋雞受精率和孵化率影響結(jié)果(表10)表明，3個(gè)組別對蛋雞受精率和孵化率影響差異不顯著(P>0.05)，但受試消毒劑組和甘油組效果略佳。

4 討論與結(jié)論

常見的畜禽消毒劑(如抗生素和各種化學(xué)試劑)雖然能夠有效抑制或殺滅病原微生物，但都因?yàn)榘踩詥栴}很難在種畜禽精液中應(yīng)用[12]。本試驗(yàn)研發(fā)的中藥消毒劑選用的板藍(lán)根、苦楝、地榆、大青葉、蘆薈等中草藥提取物，具有清熱解毒、殺菌消炎等實(shí)際功效，能夠殺滅多種病毒和有害菌[13]；果糖能夠?yàn)榫犹峁I養(yǎng)和能量[14]；甘油是常用的抗凍保護(hù)劑，能夠防止精原細(xì)胞脫水，延遲精液保存時(shí)間；檸檬酸鈉能調(diào)節(jié)精液的pH值，起緩沖保護(hù)和平衡電解質(zhì)的作用；維生素C可以抗氧化并為精子提供營養(yǎng)。同時(shí)，各成分間功效相互增益，相互協(xié)同，對精液有較好的消毒效果。

表10 中藥精液消毒劑對蛋雞受精率和孵化率的影響Tab 10 Effect of traditional Chinese medicine semen disinfectant on fertilization rate and hatching rate of laying hens

通過藥效學(xué)試驗(yàn)可知該中藥消毒劑對大腸桿菌、沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌有普適性，其中對大 腸桿菌殺滅效果最強(qiáng)。稀釋400倍的中藥消毒劑作用5 min，即對NDV具有良好的殺滅效果，達(dá)到國內(nèi)規(guī)定的病毒殺滅率標(biāo)準(zhǔn)[15]。隨著稀釋倍數(shù)增加，中藥消毒劑的殺滅效果降低，作用時(shí)間延長，殺滅效果增強(qiáng)，因此在實(shí)際使用時(shí)要按照具體情況，靈活調(diào)整消毒劑的濃度和作用時(shí)間，以達(dá)到徹底殺滅致病菌和病毒的目的。

通過急性經(jīng)口試驗(yàn)、皮膚和眼睛刺激試驗(yàn)可知，該消毒劑安全無刺激性。而申玉璽等[16]報(bào)道發(fā)現(xiàn)5種低毒化學(xué)消毒劑在低濃度下就可以有效滅活新城疫病毒，雖然安全性相對較高，但仍需另加化學(xué)緩沖劑中和殘留消毒劑，以減少和試驗(yàn)細(xì)胞的損傷。

此外，本中藥消毒劑對常溫下種雞精液中精子的生存指數(shù)影響不大，且能顯著提高冷凍條件下精子的存活率，同時(shí)還提高了蛋雞受精率和次代孵化率，可能均與該中藥消毒劑對精液中病原微生物的殺滅作用有關(guān)。其中10倍稀釋組要明顯優(yōu)于原液組和100倍稀釋組。筆者分析，消毒劑濃度偏高使得藥液中鞣酸、堿等有效成分也偏高，因而對精液精子的刺激傷害作用也增大，而消毒劑濃度降低，其中果糖和維生素C等精子有效保護(hù)因子也相對減少。因此，該消毒劑在臨床應(yīng)用時(shí)，要想既能達(dá)到殺滅精液中病原微生物的效果，又要最大限度地減少精子的損害，必須選擇一個(gè)適中稀釋消毒濃度。

本試驗(yàn)研發(fā)的中藥消毒劑原液在400倍及以上濃度稀釋應(yīng)用，可對大腸桿菌等4種常見病原菌有較好的消殺效果，在5 min內(nèi)對新城疫病毒有100%殺滅率；經(jīng)口灌胃急性毒性試驗(yàn)和粘膜染毒刺激性試驗(yàn)表明該消毒劑安全無毒無刺激；該消毒劑對種公雞精液精子刺激性影響不大，且對凍融條件下精子有較好的保護(hù)效果；通過人工授精和孵化等試驗(yàn)證明，該消毒劑對提高蛋雞受精率和次代孵化率有顯明效果。

綜上研究，建議對種畜禽精液消毒的臨床最佳方法為：在人工輸精前，將該中藥消毒劑用去離子水按10倍量稀釋后，按1∶2與采集的精液體積稀釋，并互作至少5 min。