羅 蘭，朱思宇，許芳穎，周思雨，苗艷華，談建中

(蘇州大學(xué) 建筑學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

1 引言

高等植物葉色突變是比較常見的一種表型突變，以黃化和白化較為常見，這通常是由于突變基因影響了葉綠體的發(fā)育或者是葉綠素的合成降解過程所導(dǎo)致[1]。紅掌(Anthuriumandraeanum)作為市場上重要的盆花、鮮切花及景觀裝飾植物，研究紅掌葉色突變體的呈色機理對于新奇葉色品種的選育有重要的意義，而對于紅掌葉色突變體的研究較少。目前已有研究表明紅掌不同葉片顏色中所含的葉綠體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量都有差異，這直接影響了葉綠素合成及色素生物活性[2]，但對其葉綠素代謝變化沒有深入的研究。本研究以紅掌品種“阿拉巴馬”及其葉色黃化突變體為試驗材料，研究其葉綠素及中間代謝產(chǎn)物的含量變化，旨在揭示其突變體類型和黃化的生理機制。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試材料為紅掌品種“阿拉巴馬”(野生型)的幼葉(CK-Y)、成熟葉(CK-M)和老葉(CK-A)以及葉色突變體的幼葉(Mut-Y)、成熟葉(Mut-M)和老葉(Mut-A)。葉片經(jīng)雙蒸水清洗后用濾紙擦干，液氮速凍后放置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 葉色表型調(diào)查

使用英國皇家園藝學(xué)會比色卡(RHSCC)對野生型及其葉色突變體葉片的顏色類型進行分析。

2.3 葉片葉綠素含量的測定

不同葉片的葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)含量的測定參照李合生[3]的方法，稱取0.2 g葉片，浸入10 mL體積比為1∶1的丙酮與無水乙醇混合液中，在黑暗條件下浸提48 h，并不時震蕩搖晃，直到葉片完全褪色變白。將上述混合液作為空白對照，分別在波長為663、645 nm處測定提取液的吸光度(Optical density，OD)值，上述步驟重復(fù)三次，測得的OD值代入下列公式進行計算。

Chl a含量(mg·g-1)=(12.7×A663-2.697×A645)7×V/(1000W)

(1)

Chl b含量(mg·g-1)=(22.77×A645-4.687×A663)7×V/(1000W)

(2)

式(1)、(2)中A663、A645分別為相應(yīng)波長下的OD值，V為混合液體積，W為供試葉片的質(zhì)量。

2.4 葉綠素生物合成中間代謝產(chǎn)物的測定

δ-氨基酮戊酸(ALA)的測定參照張帆[4]等人的方法進行測定；膽色素原(PBG)、尿卟啉原III(Urogen III)和糞卟啉原III(Coprogen III)的測定參照Bogorad[5]的方法；原卟啉IX(Proto IX)、鎂原卟啉IX(Mg-Proto IX)和原葉綠素酸酯(Pchl)的測定參照楊海蕓[6]的方法進行測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅掌“阿拉巴馬”葉色突變體的表型特征

野生型幼葉(CK-Y)呈正常的綠色泛紅，野生型成熟葉(CK-M)呈深綠色，野生型老葉(CK-A)與CK-M相差不大，同樣呈深綠色。突變體幼葉(Mut-Y)顏色呈現(xiàn)橘黃色，突變體成熟葉(Mut-M)呈黃綠色，突變體老葉(Mut-A)除邊緣衰老變黃外，其他部分略有轉(zhuǎn)綠。從葉色表型來看，該突變體屬于葉色黃化突變體(圖1)。

2.2 紅掌野生型與葉色突變體葉綠素含量的比較分析

采用浸提法分別對紅掌野生型及葉色突變體的幼葉、成熟葉、老葉中的葉綠素含量進行了測定，結(jié)果如圖2所示。在三個發(fā)育階段中，突變體中Chl a和Chl b的含量均顯著低于野生型，但隨著葉片發(fā)育的成熟而逐漸升高。其中，Mut-Y中Chl a和Chl b的含量分別為CK-Y的20.42%和20.93%，總?cè)~綠素含量下降了79.41%；Mut-M中Chl a和Chl b的含量分別為CK-M的26.36%和20.26%，最終總?cè)~綠素含量下降了75.37%；Mut-A中Chl a和，Chl b的含量分別為CK-A的48.59%和58.49%，最終總?cè)~綠素含量下降了48.59%。其次，從Chla/Chlb的比值來看，在突變體的幼葉、成熟葉和老葉中分別為3∶1.49、3∶0.91和3∶1.44，平均值為3∶1.28，野生型幼葉、成熟葉和老葉的Chla/Chlb之比分別為3∶1.45、3∶1.19和3∶1.19，其平均值同樣為3∶1.28。

注：括號中數(shù)值為英國皇家園藝學(xué)會比色卡代碼

3.3 紅掌野生型與葉色突變體葉綠素合成中間產(chǎn)物的比較分析

為進一步探討葉色突變體中葉綠素缺失的原因，測定了6種供試材料的葉綠素生物合成中間代謝產(chǎn)物含量，結(jié)果如圖3所示。首先，在突變體幼葉Mut-Y中，其ALA和PBG含量略高于CK-Y，而Proto IX的含量極顯著地降低，僅為CK-Y的14.73%；其下游的Mg-Proto IX和Pchl含量也極顯著地低于CK-Y，僅為CK-Y的3.23%和6.56%，最終導(dǎo)致葉綠素含量極顯著地降低。其次，在突變體成熟葉Mut-M中，其ALA、PBG及Urogen III含量雖然低于CK-M，但Coprogen III出現(xiàn)了大量積累，其下游產(chǎn)物Proto IX的合成均受到阻遏，相對含量僅為CK-M的36.78%，但與幼葉期相比已有所上升，Chla的相對含量也有所升高，而Chlb的相對含量無顯著性變化。此外，與前兩個階段不同的是，在突變體老葉Mut-A中，代謝中間產(chǎn)物的相對含量在Coprogen III處出現(xiàn)了顯著下降的現(xiàn)象，約為CK-A的50%，導(dǎo)致Coprogen III及其后續(xù)產(chǎn)物的相對含量均有下降。但總體上，相對于前兩個階段均有所升高。

圖2 紅掌葉色突變體葉綠素含量的比較

4 討論

高等植物葉綠素生物合成是以L-谷氨酰-tRNA為原料，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，最終形成Chl a和Chl b，其具體過程為Glu→ALA→Urogen III→ Coprogen III→Proto IX→ Mg-Proto IX→Pchl→Chl a→Chl b[7]，其中任意一個步驟受到阻礙均會導(dǎo)致葉綠素合成異常。本研究通過對葉綠素及其生物合成中間代謝產(chǎn)物的相對含量進行測定，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體幼葉、成熟葉和老葉中總?cè)~綠素含量分別降低了79.41%、79.58%和79.07%，但Chl a/Chl b的平均值未見差異，均為3:1.28，說明該突變體中Chl a和Chl b合成均減少，屬于總?cè)~綠素缺失型突變體。

Proto IX是葉綠素生物合成過程中十分關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，在金邊黃楊和金心黃楊的不同呈色部位中，發(fā)現(xiàn)黃色部分的葉綠素含量顯著低于綠色部分，其葉綠素合成中間產(chǎn)物Proto IX、Mg-Proto IX以及Pchl的含量均顯著低于綠色部分，推測Coprogen III合成Proto IX的過程受阻導(dǎo)致了黃色組織中葉綠素含量的顯著減少[8]。同樣地，在白肋型煙草以及芥菜型油菜黃化突變體L638-y葉片中，也在Coprogen III合成Proto IX時代謝受阻[9,10]。本研究結(jié)果表明，在突變體幼葉與成熟葉中，Proto IX的積累量極顯著地下降，僅為野生型的14.73%和36.78 %，推測該突變體的葉片黃化也是在Coprogen III合成Proto IX時受到了嚴重阻抑。

圖3 紅掌葉色突變體葉綠素及合成代謝中間產(chǎn)物含量的比較

但不同的是，在突變體老葉中，Coprogen III的積累量顯著下降；并且，Coprogen III下游的中間產(chǎn)物及葉綠素含量雖然都低于野生型，但相對于幼葉與成熟葉又表現(xiàn)為升高的變化趨勢，表型上也出現(xiàn)葉色返綠的現(xiàn)象，說明其葉綠素合成代謝的受阻部位及程度有所不同。

綜上所述，供試突變體的葉綠素含量雖然隨著葉片發(fā)育而呈持續(xù)上升的趨勢，但在整個生長期間始終低于野生型，但Chl a/Chl b比值未見差異，屬于總?cè)~綠素缺失型黃化突變體。其次，在突變體的幼葉和成熟葉中，葉綠素合成受阻位點在Coprogen III轉(zhuǎn)化為Proto IX處，而老葉在Urogen III合成Coprogen IIII時受到阻抑，但抑制作用相對降低，出現(xiàn)葉色返綠現(xiàn)象，這與前人報導(dǎo)的葉色突變體類型[2]有所不同，可以認為是一種新的紅掌葉色突變體，這在紅掌葉片呈色機理及品種選育研究方面具有重要的應(yīng)用價值。