周鴻銘，李鐵臣

(皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

近年來有研究發(fā)現(xiàn)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[1-2]。AMPA受體是一種離子型谷氨酸受體，有4種亞型(GluR1、GluR2、GluR3、GluR4)，在海馬神經(jīng)元突觸發(fā)生及突觸可塑性等方面起著重要作用[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)在抑郁癥患者大腦前葉皮層及海馬中GluR1表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)在抑郁癥動物模型中也發(fā)現(xiàn)海馬GIuR1的表達(dá)水平明顯降低[4-6]。而研究發(fā)現(xiàn)TAK-653作為一種AMPA受體調(diào)節(jié)劑，通過減緩海馬AMPA受體脫敏或失活來增強(qiáng)受體功能而緩解抑郁癥的癥狀，但這種調(diào)節(jié)劑由于其毒性較大，目前仍處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段[7-8]。以上結(jié)果表明AMPA功能下調(diào)與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān)，而調(diào)控AMPA受體有望治療抑郁癥。

茯苓多糖(pachymaran)是傳統(tǒng)中藥茯苓的有效成分之一，具有抗炎、提高免疫力及神經(jīng)保護(hù)等作用[9-10]。近期研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對記憶障礙小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯改善作用[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)某些中藥的有效成分(如蟲草素、香菇多糖等)具有明顯的抗抑郁療效，其機(jī)制可能與其影響海馬AMPA受體p-GluR1水平并上調(diào)GluR1的表達(dá)有關(guān)[12-13]?；谝陨系难芯勘尘?，本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)卵巢摘除加慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激抑郁癥大鼠模型，以AMPA受體為切入點(diǎn)，探討茯苓多糖的抗抑郁作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 SD大鼠(清潔級，雌性，12月，體質(zhì)量 500～550 g)，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物試驗(yàn)中心，許可證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 藥物及主要試劑 硫酸茯苓多糖(sulfated pachymaran，SP)(純度95%)，由陜西金潤生物科技有限公司提供(批號180308-1)。尼氏染色試劑盒(上海碧云天)。GYKI 52466(美國Abcam)。抗IL-1β、IL-6、TNF-α及GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)?？笹luR1、p-GluR1、PKA、p-PKA、TrkB、p-TrkB、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗體(美國Abcam公司)。抗PI3K、p-PI3K抗體(美國CST公司)。Luminata Crescendo Western HRP Substrate(美國Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 抑郁癥大鼠模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)文獻(xiàn)[14]采用雙側(cè)卵巢摘除與慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激實(shí)驗(yàn)(CUMS)兩步法復(fù)制抑郁癥動物模型。本研究設(shè)抑郁癥模型組(Model組)，SP(25、50、100 mg/kg)劑量組(SP25組、SP50組、SP100組)及SP(100 mg/kg)+ GYKI 52466(3 mg/kg)劑量組(GYKI抑劑組)，另設(shè)假手術(shù)組(Sham組)，每組12只。假手術(shù)組除不切除雙側(cè)卵巢外，其余手術(shù)方法與模型組相同。SP和GYKI 52466分別采用灌胃和腹腔注射給藥。共計(jì)給藥21 d。在21 d實(shí)驗(yàn)期間模型組及各給藥物組大鼠給予的應(yīng)激刺激包括：3次電擊(平均電流1 mA，持續(xù) 10 s，每隔 1 min刺激 1 次)；3次24 h禁食；3次夾尾(每次1 min，每隔 5 min夾尾 1 次)；3次4℃冰水游泳5 min；3次40℃環(huán)境中5 min；兩次晝夜循環(huán)顛倒；兩次居住環(huán)境改變(24 h轉(zhuǎn)移至另一房間中的新籠中)；兩次高速水平震蕩30 min。各種應(yīng)激刺激隨機(jī)應(yīng)用，每日給予1種刺激。

1.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 末次應(yīng)激刺激后24～48 h內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，具體方法詳見文獻(xiàn)[15]。大鼠游泳6 min，觀察記錄后4 min 內(nèi)大鼠累計(jì)不動時(shí)間。

1.3.3 敞箱實(shí)驗(yàn) 末次應(yīng)激刺激后24～48 h內(nèi)進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)，具體方法詳見文獻(xiàn)[15]。記錄6 min內(nèi)動物在曠場內(nèi)垂直運(yùn)動(記錄大鼠站立次數(shù)，雙前足離地1 次為1 分)和水平運(yùn)動(3 或4 只足同在一個格內(nèi)計(jì)1 分或穿越1 格計(jì)1 分)得分。

1.3.4 糖水消耗試驗(yàn) 應(yīng)激刺激開始的前1天和結(jié)束后1天各進(jìn)行一次糖水消耗試驗(yàn)，具體方法詳見文獻(xiàn)[16]。分別計(jì)算2次大鼠的淡水、糖水和總水消耗量、糖水偏愛百分比(糖水消耗量/總水消耗量× 100%)。

1.3.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥后第15天開始對各組大鼠進(jìn)行5天的游泳訓(xùn)練，第20 天進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，具體方法詳見文獻(xiàn)[15]。

1.3.6 海馬病理檢測 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈放血處死大鼠，開顱取腦，參照《大鼠腦讀片提要及圖譜》分離海馬組織。固定、包埋、切片后，按尼氏染色步驟進(jìn)行染色，光鏡下觀察病理變化。

1.3.7 Western blot檢測大鼠海馬AMPA受體GluR1及其相關(guān)信號蛋白的表達(dá) 低溫條件下提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。Western blot具體操作方法詳見我們前期研究成果[17]。相關(guān)蛋白一抗?jié)舛确謩e為GluR1(1∶1000)、p-GluR1(1∶1000)，相應(yīng)二抗?jié)舛?1∶2000～1∶5000)。將目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 SP對抑郁癥大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加(P<0.05)；與模型組相比，SP50組、SP100組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間均減少(P<0.05)；與SP100組相比，GYKI抑劑組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加(P<0.05)。見表1。

2.2 SP對抑郁癥大鼠自發(fā)活動的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠垂直運(yùn)動與水平運(yùn)動減少(P<0.05)；與模型組相比，SP25組、SP50組、SP100組大鼠垂直運(yùn)動與水平運(yùn)動增加(P<0.05)；與SP 100組相比GYKI抑劑組大鼠垂直運(yùn)動與水平運(yùn)動減少(P<0.05)。見表1。

2.3 SP對抑郁癥大鼠糖水偏愛度的影響 結(jié)果顯示，給藥前各組大鼠總水、糖水、淡水消耗量和糖水偏愛百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥后各組大鼠總水消耗量差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組相比，給藥后模型組大鼠淡水消耗量增加而糖水消耗量及糖水偏愛百分比降低(P<0.05)；與模型組相比，給藥后SP25組、SP50組、SP100組淡水消耗量降低而糖水消耗量及糖水偏愛百分比均升高(P<0.05)；與SP100組相比，GYKI抑劑組淡水消耗量增加而糖水消耗量及糖水偏愛百分比降低(P<0.05)。見表2。

表1 SP對抑郁癥大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間、水平及垂直運(yùn)動的影響

表2 各組大鼠糖水消耗量、淡水消耗量、總液體消耗量、糖水偏愛百分比

2.4 SP對抑郁癥大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長而穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組相比，SP25組、SP50組、SP100組大鼠逃避潛伏期均降低而穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；與SP100組相比，GYKI抑劑組大鼠逃避潛伏期延長而穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。見表3。

2.5 SP對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元病理變化的影響 尼氏染色結(jié)果顯示假手術(shù)組海馬神經(jīng)元分層明顯，排列規(guī)則，胞膜結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)豐富，胞核明顯。而模型組海馬神經(jīng)元分層不清楚，排列紊亂，胞膜皺縮，染色質(zhì)聚集、胞核不清楚。給予不同劑量SP 21 d后，上述病理損傷減輕。但與SP100劑量組相比，GYKI 52466能夠減弱SP對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。見圖1。

2.6 SP對抑郁癥大鼠海馬AMPA受體GluR1表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬AMPA受體GluR1及p-GluR1蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)；與模型組相比，SP50組、SP100組大鼠GluR1及p-GluR1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與SP100組相比，GYKI抑劑組海馬GluR1及p-GluR1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表4和圖2。

表3 SP對抑郁癥大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的影響

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)變化(×400)

表4 SP對抑郁癥大鼠海馬GluR1及p-GluR1蛋白表達(dá)的影響

圖2 SP對抑郁癥大鼠海馬GluR1及p-GluR1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

抑郁癥是一類臨床上常見的精神障礙，以持續(xù)的心境低落、思維遲緩和意志活動減退為主要臨床癥狀，常伴有睡眠障礙、食欲減退、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)[18]。目前抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，其治療主要依靠藥物和心理治療，治療藥物主要是一些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的選擇性再攝取抑制劑，而這些抗抑郁藥物都存在起效慢、副作用大等缺點(diǎn)，因此研究起效快且副作用小的抗抑郁藥顯得尤為重要。大量研究表明中藥柴胡、人參、黃芪、銀杏、貫葉金絲桃等及其有效成分在治療抑郁癥方面具有不良反應(yīng)少、療效穩(wěn)定且患者易于接受、依從性好等優(yōu)點(diǎn)[19]。茯苓多糖是從傳統(tǒng)中藥茯苓中提取的有效成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫力、神經(jīng)保護(hù)等作用[9-10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對記憶障礙小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯改善作用[11]。而本研究發(fā)現(xiàn)，給予SP 21 d后抑郁癥大鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間減少而自發(fā)活動增加，同時(shí)糖水?dāng)z入量及糖水偏愛百分比升高，空間學(xué)習(xí)與記憶能力增強(qiáng)。這些研究結(jié)果表明SP具有很好的抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，其中相關(guān)的神經(jīng)元性假說成為今年的研究熱點(diǎn)[20]。研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激狀態(tài)下可以引起炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)明顯增加，進(jìn)而導(dǎo)致與情緒密切相關(guān)的邊緣系統(tǒng)尤其是海馬結(jié)構(gòu)損害。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)抑郁癥可以引起海馬萎縮，影響神經(jīng)元再生，導(dǎo)致海馬體積變小[21]。谷氨酸(Glu)是海馬中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體分為離子型(iGluR)和代謝型(mG1uR)兩大類。而Glu受體又分為AMPA受體、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和海人藻酸(KA)受體。AMPA受體主要介導(dǎo)腦內(nèi)興奮性突觸傳遞，近年來研究發(fā)現(xiàn)AMPA受體功能失調(diào)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[22]。有研究表明，促炎因子如IL-1β可降低海馬腦區(qū)AMPA受體的膜表達(dá)水平，抑制突觸后膜長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)，而通過抗炎、抑制炎癥因子IL-1β的水平可增強(qiáng)AMPA受體介導(dǎo)的突觸后膜LTP，起到抗抑郁作用[23]。另外單獨(dú)使用AMPA受體激動LY 392098也可產(chǎn)生抗抑郁樣效果，而氟西汀的抗抑郁作用與其增加抑郁癥大鼠海馬AMPA受體的表達(dá)有關(guān)[24]。而最新的研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮的抗抑郁作用可能也是通過激活A(yù)MPA受體而實(shí)現(xiàn)[25]。同時(shí)一些中藥的有效成分如蟲草素、香菇多糖抗抑郁效果與調(diào)節(jié)海馬AMPA受體介導(dǎo)的神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP給藥21 d后，海馬神經(jīng)元損傷減輕，AMPA受體GluR1和p-GluR1表達(dá)水平均升高，而AMPA受體抑制劑GYKI 52466完全抑制SP的抗炎、上調(diào)AMPA受體的作用。這些結(jié)果表明SP抗抑郁效果可能是通過抗炎、調(diào)節(jié)AMPA受體GluR1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。