董嬌嬌，夏芳芳，金周晟，張?jiān)?jiān)，劉樂

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

體外循環(huán)心臟直視手術(shù)及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療不可避免地造成了心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷[1]。Intralipid是以大豆油為基礎(chǔ)的長鏈脂肪乳劑，是世界上第一個(gè)安全應(yīng)用于人體的脂肪乳劑。Intralipid后處理對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)機(jī)制主要涉及再灌注損傷補(bǔ)救激酶通路、脂肪酸氧化增強(qiáng)心肌收縮力等[2-3]。本研究通過構(gòu)建在體大鼠心肌I/R模型，監(jiān)測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死面積和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放量，探討Intralipid缺血前短期預(yù)處理的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組7只）：假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、長鏈脂肪乳劑組（LE組）。Sham組不予以任何藥物處理，建模時(shí)只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending，LAD）；Model組于造模前予以0.9%氯化鈉溶液2 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射5 d；LE組于造模前予以Intralipid 2 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射5 d，2組末次給藥后24 h建立大鼠左前降支結(jié)扎I/R模型。

1.1.2 試劑與儀器：Intralipid（批號(hào)：801H081，無錫華瑞制藥有限公司），LDH測(cè)試盒（A020-2型，南京建成生物工程研究所），穿刺針（14 G， Introcan-W，馬來西亞B.Braun公司），動(dòng)物呼吸機(jī)（HX-300型，成都泰盟科技有限公司），生物信號(hào)采集系統(tǒng)（Medlab-U/4C051，南京美易科技有限公司），Mer-silk慕絲縫線（上海強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司），光吸收全波長酶標(biāo)儀（瑞士Tecan Infinite公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠心肌I/R損傷模型：末次給藥后24 h， 將SD大鼠行水合氯醛（350 mg/kg）腹腔基礎(chǔ)麻醉加七氟烷（1%～2%）吸入維持麻醉。待動(dòng)物麻醉后，切開氣管置入14 G穿刺針外套管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。呼吸參數(shù)設(shè)定：潮氣量=6 mL·kg-1，呼吸頻率=68次/min， 呼吸比3:2，F(xiàn)iO2100%?？刂企w溫在38～39 ℃。開放左股靜脈補(bǔ)充生理需要量（5 mL·kg-1·h-1），左股動(dòng)脈切開置管，連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)，測(cè)定平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）、心率（HR）、心率與收縮壓的乘積（rate-pressure product，RPP）。操作結(jié)束后平衡15 min，將大鼠左側(cè)胸壁逐層離斷，結(jié)扎并移除第3、4肋骨，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。不同時(shí)間點(diǎn)間比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)比較 3組大鼠的體質(zhì)量及血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 3組大鼠梗死面積及LDH比較 再灌注120 min末Model組和LE組AAR/LV均顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Model組與LE組AAR/LV比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Model組和LE組的IR/AAR和IR/LV均顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)潮氣量=7.5 mL·kg-1，呼吸頻率=68次/min，呼吸比3:2，F(xiàn)iO2100%。打開心包直視下將6-0 Mersilk慕絲縫線結(jié)扎LAD。結(jié)扎成功標(biāo)志：心電圖ST段抬高、R波增寬加深及LAD供血區(qū)心肌顏色變?yōu)樽习咨?。結(jié)扎成功后，用橡膠薄膜貼附在胸壁開口處，消除開放性氣胸。結(jié)扎缺血30 min后，松開結(jié)扎線再灌注120 min。

1.2.2 觀察血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：記錄3組平衡末（基礎(chǔ)值），缺血期0、5、10、15、20、25、30 min，再灌注期0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 min時(shí)的HR、MAP、RPP。

1.2.3 伊文思藍(lán)（EB）-2，3，5一氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法確定心肌梗死面積：再灌注期末，結(jié)扎絲線，經(jīng)左股動(dòng)脈取血后，注射2.5 mL 2% EB染料。待結(jié)扎區(qū)外心肌染為藍(lán)色后，沿心底部剪下心臟，沖洗后放入-20 ℃冰箱冷凍25～30 min。取出后將結(jié)扎線以下部位切2 mm薄片，共5片。放入含有1%的TTC凍存管中超聲波振動(dòng)10 min，取出沖洗并放入4%甲醛中固定6～8 h后拍照保存，梗死面積用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析并計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)心肌占左室面積百分比（AAR/LV）、梗死面積占危險(xiǎn)區(qū)心肌百分比（IR/AAR）、梗死面積占左室面積百分比（IR/LV）。

1.2.4 檢測(cè)血清LDH：再灌注期末經(jīng)股動(dòng)脈取血 3 mL，3 500×g，4 ℃離心15 min，取上清液于 -80 ℃冰箱保存，采用光吸收全波長酶標(biāo)儀測(cè)定血清LDH含量。計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Model組比，LE組IR/AAR和IR/LV顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Model組和LE組血漿LDH濃度均顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Model組比較，LE組血漿LDH濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 3組大鼠的體質(zhì)量和血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)值（每組n=7， ）

表1 3組大鼠的體質(zhì)量和血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)值（每組n=7， ）

組別 體質(zhì)量（g） HR（beat·min-1） MAP（mmHg） RPP（mmHg·beat·min-1）Sham組 278±16 380±30 90± 9 44 537±4 441 Model組 276±14 413±36 84±16 43 339±9 966 LE組 268±17 404±49 78±13 41 903±3 469F0.777 1.360 1.500 0.279P0.475 0.282 0.250 0.760

2.3 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時(shí)間點(diǎn)HR比較 Model組和LE組大鼠缺血期及再灌注期HR均呈先升高后降低，3組間缺血期及再灌注期HR比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

表2 3組再灌注120 min末AAR/LV、IR/AAR、IR/LV及血漿LDH的比較（每組n=7， ）

表2 3組再灌注120 min末AAR/LV、IR/AAR、IR/LV及血漿LDH的比較（每組n=7， ）

與Sham組比：aP＜0.05；與Model組比：bP＜0.05

組別 AAR/LV（%） IR/AAR（%） IR/LV（%） LDH（U/gprot）Sham組 1.00 0 0 2 463.58±234.23 Model組 0.52±0.09a0.67±0.14a0.36±0.09a5 431.00±215.97aLE組 0.54±0.06a0.49±0.10ab0.26±0.06ab4 728.00±191.29abF174.557 48.562 59.626 365.806P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 3組缺血期（A）及再灌注期（B）不同時(shí)間點(diǎn)HR圖

2.4 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時(shí)間點(diǎn)MAP比較 Model組在缺血期（5、10、15、20、25、 30 min）MAP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），見圖2A；Model組在再灌注期（除80、95、100、115 min外）MAP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B；與Sham組比，LE組缺血期及再灌注期MAP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.5 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時(shí)間點(diǎn)RPP比較 Model組在缺血期（10、15、20、25、30 min）RPP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3A；Model組在再灌期（10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、105、120 min）RPP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B；與Sham組比，LE組缺血期及再灌注期RPP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

3 討論

圖3 3組缺血期（A）及再灌注期（B）不同時(shí)間點(diǎn)RPP圖

大鼠LAD結(jié)扎30 min再灌注120 min模型目前被廣泛應(yīng)用于心肌I/R的相關(guān)研究[4]，EB-TTC染色后計(jì)算得到的心肌梗死面積相關(guān)指標(biāo)是判斷心肌I/R損傷最常見的指標(biāo)[5]。本課題組在之前的研究中采用Intralipid和布比卡因共同孵育心肌細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)Intralipid能夠逆轉(zhuǎn)布比卡因引起的心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低[6]。20%的Intralipid中含有200 g·L-1甘油三酯，其中52%為ω-6亞油酸，8%為ω-3亞麻酸。有研究證實(shí)ω-6和ω-3多不飽和脂肪酸通過改變細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性從而激活重要的生物介質(zhì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)、免疫應(yīng)答等途徑的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[7]。細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對(duì)于再灌注損傷的保護(hù)起到重要作用。因此，認(rèn)為Intralipid預(yù)處理通過改變膜磷脂成分維持細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而減小心肌I/R損傷后梗死面積，減少LDH的釋放。

PAULSON等[8]通過灌注L-propionylcarnitine促進(jìn)離體大鼠心肌細(xì)胞的脂肪酸氧化過程，提高心肌ATP濃度，結(jié)果顯著促進(jìn)了大鼠心肌I/R損傷后心肌收縮力的恢復(fù)。同時(shí)，有研究認(rèn)為脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因心臟毒性在于其正性肌力作用[9]。本研究中大鼠LAD結(jié)扎致使大鼠左心室結(jié)扎部位以下的心肌收縮力減弱，導(dǎo)致MAP急劇下降。然而LE組大鼠缺血期MAP下降不明顯，在不考慮外周循環(huán)阻力和循環(huán)血流量發(fā)生變化的情況下，可以將LE組MAP的穩(wěn)定歸因于心肌收縮力變化小，從而表明LE組心肌對(duì)缺血缺氧的耐受力高于Model組，最終使得LE組缺血期RPP能夠恢復(fù)至Sham組水平。缺血使得細(xì)胞內(nèi)ATP減少，離子通道功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載并裂解死亡。LE組在缺血前Intralipid預(yù)處理 5 d，長鏈脂肪酸在體內(nèi)經(jīng)過氧化生成ATP，心肌ATP儲(chǔ)備高于Model組，對(duì)缺血期ATP的耗竭起到重要的緩沖作用，從而減輕心肌損傷。另外，有研究認(rèn)為低濃度的脂肪酸能夠氧化生成ATP提供能量，而高濃度的脂肪酸則會(huì)加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載從而引起細(xì)胞死亡[10]，MONTI等[11]采用10、20、40 mg·mL-1甘油三酯進(jìn)行離體大鼠心臟灌注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再灌注期心臟收縮和舒張功能隨著甘油三酯灌注濃度的增加而變差，而本研究采用20% Intralipid 2 mg·kg-1·d-1預(yù)處理，考慮大鼠血液量占體質(zhì)量約7%，計(jì)算得到Intralipid給藥后大鼠體內(nèi)甘油三酯最高血液濃度不超過5.71 mg·mL-1，顯著低于MONTI等[11]采用的劑量。

缺血再灌注損傷和自由基攻擊緊密相關(guān)，有研究表明長鏈脂肪乳劑的包裹機(jī)制有利于減少再灌注產(chǎn)生的脂溶性有害物質(zhì)從而減輕遠(yuǎn)隔臟器的再灌注損傷[7]。再灌注期自由基大量產(chǎn)生，造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，無氧代謝增加，血管麻痹，從而導(dǎo)致循環(huán)障礙。本研究結(jié)果示Model組再灌注初期0至 40 min MAP及RPP呈持續(xù)降低狀態(tài)，而LE組再灌注期MAP和RPP水平均跟Sham組相仿，這和長鏈脂肪乳劑包裹再灌注期脂溶性有害物質(zhì)密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明20% Intralipid 2 mg·kg-1·d-1預(yù)處理5 d能夠顯著減小大鼠心肌I/R損傷后心肌梗死面積，減少LDH釋放，同時(shí)促進(jìn)血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)，并推論其保護(hù)機(jī)制可能包括以下三點(diǎn)：改變膜磷脂成分維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、脂肪酸氧化提供能量以及脂肪乳劑包裹脂溶性有害物質(zhì)。