葛淑瑜,李嵐,孫萍萍
(1.浙江省立同德醫(yī)院 藥學(xué)部,浙江 杭州 310005;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科,浙江 杭州 310006)
支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的一種高發(fā)病率慢性炎癥疾病,炎癥反應(yīng)在哮喘中發(fā)揮著重要作用[1-2]。哮喘氣道炎癥反應(yīng)往往伴隨著嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等白細胞浸潤以及各種炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-13水平上調(diào)[3]。目前臨床上多采用糖皮質(zhì)激素、β受體激動劑、免疫抑制藥物治療急性或慢性哮喘,雖然療效顯著,但均存在一定的不良反應(yīng),可能會導(dǎo)致患者出現(xiàn)藥物依賴性、肺功能下降、患腫瘤概率增加以及誘發(fā)多種感染。因此尋找療效顯著但不良反應(yīng)更小的哮喘治療藥物意義重大[4]。
桑白皮為??浦参锷5母稍锔?,是一種傳統(tǒng)中草藥,具有平喘、止咳、潤肺、利水消腫等療效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明桑白皮具有免疫活性、降血脂、抗氧化、抗炎癥、抗菌和抗病毒等活性。桑白皮的主要成分為酚類化合物和黃酮類化合物。黃酮類化合物廣泛存在于多種藥用植物中,被認為是最安全的生物活性物質(zhì)之一。有研究報道桑葉中的黃酮化合物可以抑制糖毒性導(dǎo)致的細胞凋亡[5],陳皮中的黃酮可以顯著降低哮喘氣道炎癥反應(yīng)過程中的IgE、IL-4、IL-13水平的上調(diào),緩解哮喘癥狀[6]。 目前桑白皮中的黃酮類物質(zhì)對于哮喘的作用效果尚不明確。本研究旨在探討桑白皮總黃酮(total flavonoids of cortex mori,TFCM)對哮喘模型小鼠氣道炎癥反應(yīng)的影響以及影響機制,以明確其對哮喘的治療效果。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物:健康清潔級雌性C57BL/6小鼠60只,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK(滬)2018-0006,體質(zhì)量18~ 20 g。于室溫(22±2)℃,濕度50%~60%,光照每12 h明暗交替飼養(yǎng),小鼠飼料采用不含致敏原的特殊飼料。
1.1.2 試劑:卵清蛋白(ovalbumin,OVA)購自北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司,地塞米松購自上海源葉生物科技有限公司,IL-4、IL-5、IL-13、黏蛋白MUC5AC、MUC5B、IgE、嗜酸性粒細胞活化因子Eotaxin ELISA試劑盒購自武漢酶免生物科技有限公司。
1.1.3 儀器:超聲波清洗器購自上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司,小動物霧化給藥儀購自南京賽昂斯生物科技有限公司,動物肺功能檢測系統(tǒng)購自德國EMKA公司,酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司,光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司,低溫高速離心機購自美國賽默飛公司。
1.2 方法
1.2.1 TFCM制備:稱取桑白皮200 g,粉碎后加入乙醚500 mL,浸泡4 h。過濾后得到浸出液,在濾渣中再次加入500 mL乙醚沖洗濾渣,重復(fù)操作2次,將乙醚回收。隨后在濾渣中加入50%乙醇600 mL,于50 ℃超聲萃取30 min后過濾,濾渣再用600 mL 50%乙醇超聲萃取后過濾,重復(fù)操作2次,合并所有乙醇濾液95 ℃水浴蒸干得TFCM,冰箱冷藏備用[7]。
1.2.2 動物分組及哮喘模型建立:按隨機數(shù)字表法將60只小鼠分為正常組、模型組、TFCM低劑量組(50 mg/kg)、TFCM中劑量組(100 mg/kg)、TFCM高劑量組(200 mg/kg)和陽性對照組(地塞米松 0.5 mg/kg),每組10只。模型組、TFCM各劑量組及陽性對照組均給予總共0.5 mL的2 mg/mL的OVA溶液(用4%的氫氧化鋁凝膠配制)于兩后足、腹股溝、背部皮下、頸部皮下及腹腔注射致敏,致敏第14天繼續(xù)腹腔注射0.2 mL OVA溶液加強致敏,第23天開始霧化吸入含10 mg/mL的OVA的0.9%氯化鈉溶液,每周3次,每次30 min,連續(xù)8周。正常組給予等量0.9%氯化鈉溶液致敏和霧化激發(fā)。每次霧化前1 h,各劑量組灌胃給予50、100、200 mg/kg TFCM,陽性對照組灌胃給予0.5 mg/kg地塞米松,正常組、模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。
1.2.3 氣道反應(yīng)性測定:每組隨機選取3只小鼠進行氣道反應(yīng)性測定,在末次霧化吸入24 h后,將清醒狀態(tài)的小鼠放入EMKA動物肺功能檢測系統(tǒng),待小鼠呼吸穩(wěn)定后,依次吸入0.9%氯化鈉溶液、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL的乙酰甲膽堿(methacholine,Mch)溶液50 μL,記錄小鼠肺阻力和肺動態(tài)順應(yīng)性數(shù)據(jù)。
1.2.4 標(biāo)本收集:在末次霧化激發(fā)24 h后,用戊巴比妥鈉麻醉小鼠,氣管插管,結(jié)扎左肺上葉,行肺泡灌洗得到支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。將BALF于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,用于IL-4、IL-5、IL-13、MUC5AC、 MUC5B、Eotaxin水平測定。收集細胞沉淀用于細胞總數(shù)及白細胞分類計數(shù)。對小鼠進行眼球采血,采集的血液于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,收集上清用于IgE水平測定。后處死動物,取右肺組織,用4%中性甲醛固定,石蠟包埋、切片,用于HE染色和AB-PAS染色。
1.2.5 BALF中總細胞及白細胞分類計數(shù):用60 μL PBS重懸BALF細胞,吸取10 μL細胞懸液至細胞計數(shù)板于顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù);取20 μL細胞懸液涂片做瑞氏-吉姆薩染色,在顯微鏡下依據(jù)形態(tài)學(xué)特點將細胞分為淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞,然后進行計數(shù)。
1.2.6 BALF中IL-4、IL-5、IL-13、MUC5AC、MUC5B、Eotaxin水平測定:采用ELISA試劑盒嚴格按照說明書操作,根據(jù)吸光度(OD)值計算各待測物質(zhì)含量。
1.2.7 血清中IgE水平測定:嚴格按照IgE ELISA試劑盒說明進行操作,根據(jù)OD值計算IgE含量。
1.2.8 HE染色:將小鼠肺組織用4%中性甲醛固定后脫水包埋制成蠟塊,將蠟塊切成4 μm厚切片,HE染色,觀察氣道炎癥細胞浸潤情況。
1.2.9 AB-PAS染色:將小鼠肺組織用4%中性甲醛固定后脫水包埋制成蠟塊,將蠟塊切成4 μm厚切片,AB-PAS染色,觀察黏液分泌情況判斷杯狀細胞增生。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以表示,采用單因素方差分析進行組間比較,方差齊時采用LSD法進行組間兩兩比較,方差不齊時采用Games-Howell檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組小鼠氣道反應(yīng)性比較 各組小鼠肺阻力和肺順應(yīng)性基礎(chǔ)值相近,每組小鼠肺阻力均隨著Mch激發(fā)濃度升高而升高,肺順應(yīng)性均隨著Mch激發(fā)濃度升高而降低;當(dāng)用0.9%氯化鈉溶液和0.0625 mg/mL Mch激發(fā)時,各組間的肺阻力和肺順應(yīng)性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)分別采用0.125、0.25、0.5、1 mg/mL Mch激發(fā)時模型組肺阻力顯著高于正常組,肺順應(yīng)性顯著低于正常組(P<0.05);當(dāng)分別采用0.25、0.5、1.0 mg/mL Mch激發(fā)時,TFCM劑量組肺阻力顯著低于模型組,肺順應(yīng)性顯著高于模型組(P<0.05),且呈劑量依賴性(見表1-2)。
表1 各組小鼠不同劑量Mch激發(fā)時的肺阻力比較[n=3, ,cmH2O/(mL·s)]
表1 各組小鼠不同劑量Mch激發(fā)時的肺阻力比較[n=3, ,cmH2O/(mL·s)]
與正常組比:aP<0.05;與模型組比:bP<0.05
組別 0.9%氯化鈉溶液 0.0625 0.125 0.25 0.5 1.0正常組 1.93±0.07 2.00±0.11 2.17±0.19 2.41±0.12 2.61±0.18 2.83±0.18模型組 1.96±0.06 2.20±0.13 3.37±0.34a6.57±0.42a9.36±0.52a14.16±1.60aTFCM低劑量組 1.96±0.05 2.19±0.22 3.22±0.22 6.05±0.58 8.09±0.15b12.27±0.98bTFCM中劑量組 1.97±0.08 2.14±0.09 3.12±0.40 5.41±0.43b7.38±0.48b11.04±1.06bTFCM高劑量組 1.90±0.10 2.14±0.19 2.92±0.38 4.98±0.31b6.16±0.10b 8.76±0.44b陽性對照組 1.87±0.88 2.12±0.03 2.82±0.37 4.65±0.32b5.22±0.31b 6.79±0.45bF0.738 0.722 5.067 42.025 154.023 59.782P0.609 0.619 0.010 <0.001 <0.001 <0.001
2.2 各組小鼠BALF中細胞總數(shù)及細胞分類計數(shù) 模型組小鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞數(shù)量均顯著高于正常組(P<0.05),TFCM中、高劑量組以及陽性對照組細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞均顯著低于模型組(P<0.05),TFCM低劑量組中性粒細胞、嗜酸性粒細胞低于模型組(P<0.05)。各劑量組淋巴細胞數(shù)量與模型組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。
2.3 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin水平比較 模型組BALF中IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin 水平均顯著高于正常組(P<0.05),TFCM各劑量組和陽性對照組BALF中IL-4水平低于模型組,在中、高劑量組中更為顯著(P<0.05);TFCM高劑量組和陽性對照組IL-5水平顯著低于模型組(P<0.05);TFCM 各劑量組和陽性對照組IL-13、Eotaxin水平均顯著低于模型組(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表4。
2.4 各組小鼠血清IgE水平及BALF中MUC5AC、MUC5B表達水平比較 模型組小鼠血清IgE水平和BALF中MUC5AC、MUC5B表達水平顯著高于正常組(P< 0.05);TFCM中、高劑量組和陽性對照組血清IgE水平顯著低于模型組(P<0.05);TFCM各劑量組和陽性對照組MUC5AC、MUC5B表達水平均顯著低于模型組(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表5。
表2 各組小鼠不同劑量Mch激發(fā)時的肺順應(yīng)性比較(n=3, ,mL/cmH2O)
表2 各組小鼠不同劑量Mch激發(fā)時的肺順應(yīng)性比較(n=3, ,mL/cmH2O)
與正常組比:aP<0.05;與模型組比:bP<0.05
組別 0.9%氯化鈉溶液 Mch濃度(mg/mL)0.0625 0.125 0.25 0.5 1.0正常組 0.051±0.002 0.050±0.002 0.048±0.002 0.047±0.001 0.045±0.003 0.041±0.001模型組 0.051±0.002 0.045±0.002 0.040±0.001a0.033±0.003a0.027±0.003a0.020±0.002aTFCM低劑量組 0.051±0.004 0.046±0.002 0.040±0.002 0.035±0.002 0.029±0.002 0.023±0.001 TFCM中劑量組 0.050±0.005 0.046±0.001 0.041±0.001 0.037±0.001b0.033±0.001b0.026±0.002bTFCM高劑量組 0.050±0.003 0.047±0.002 0.042±0.002 0.041±0.002b0.035±0.002b0.029±0.003b陽性對照組 0.050±0.003 0.047±0.001 0.044±0.002b0.043±0.003b0.036±0.003b0.031±0.004bF0.044 2.566 11.647 18.037 16.889 28.484P0.999 0.084 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
表3 各組小鼠BALF中總細胞及白細胞分類計數(shù)(n=7, ,105/mL)
表3 各組小鼠BALF中總細胞及白細胞分類計數(shù)(n=7, ,105/mL)
與正常組比:aP<0.05;與模型組比:bP<0.05
組別 細胞總數(shù) 淋巴細胞 中性粒細胞 嗜酸性粒細胞 巨噬細胞正常組 4.32±0.39 0.62±0.04 0.26±0.22 0.43±0.03 1.80±0.19模型組 29.19±3.05a3.34±0.45 2.10±0.34a5.81±0.32a9.36±0.87aTFCM低劑量組 26.24±2.34 2.09±0.27 1.43±0.08b5.24±0.30b8.94±0.22 TFCM中劑量組 21.63±2.54b1.86±0.12 1.17±0.26b4.75±0.40b7.95±0.41bTFCM高劑量組 15.57±2.42b1.29±0.12 0.72±0.12b3.51±0.25b6.77±0.42b陽性對照組 14.91±1.78b1.11±0.03 0.58±0.21b3.22±0.38b6.14±0.38bF48.075 23.482 27.081 120.752 103.557P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
表4 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin水平比較(n=7, ,pg/mL)
表4 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin水平比較(n=7, ,pg/mL)
與正常組比:aP<0.05;與模型組比:bP<0.05
組別 IL-4 IL-5 IL-13 Eotaxin正常組 56.24±11.36 32.40± 7.61 19.29±3.85 750.61±156.51模型組 83.14±10.28a113.32±19.29a66.26±6.67a2 092.17±157.29aTFCM低劑量組 76.58± 4.26b105.16±15.58 57.27±6.87b1 878.16± 59.05bTFCM中劑量組 72.61± 5.70b 88.25±10.81 51.50±4.06b1 663.61±113.33bTFCM高劑量組 66.81± 5.22b 76.81± 8.83b40.65±5.66b1 149.66±137.16b陽性對照組 58.70± 4.58b 53.06± 6.38b36.98±4.28b1 203.73±107.23bF11.752 38.004 57.644 96.208P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001
2.5 HE染色 HE染色觀察發(fā)現(xiàn),正常組小鼠肺組織氣道周圍無炎性細胞浸潤,其余部位亦無異狀;模型組氣道周圍有大量炎性細胞浸潤,且可見支氣管管壁增厚,肺泡間隔增寬;各TFCM劑量組氣道周圍炎性細胞浸潤較模型組減少,其他氣道炎癥癥狀減輕,高劑量組尤為明顯,更接近正常組,見圖1。
2.6 AB-PAS染色 與正常組比,模型組小鼠黏液分泌顯著增多,支氣管壁上皮細胞增多且伴隨杯狀細胞增生;TFCM各劑量組與模型組相比小鼠肺組織黏液分泌和杯狀細胞增生減少,且高劑量組尤為明顯,見圖2。
表5 各組小鼠血清中IgE濃度以及BALF中MUC5AC、MUC5B表達水平(n=7,
圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(a-f:×200;A-F:×400)
圖2 各組小鼠肺組織AB-PAS染色結(jié)果(a-f:×200;A-F:×400)
桑白皮具有降血脂、抗氧化、抗炎癥、抗菌和抗病毒等特性,在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛用于糖尿病和高血脂的治療。有研究表明桑白皮提取物口服治療可以降低非酒精性脂肪肝合并2型糖尿病大鼠的血脂水平并逆轉(zhuǎn)胰島素的耐受性[13]。目前已有研究探討桑白皮提取物對小鼠哮喘氣道炎癥的作用,發(fā)現(xiàn)桑白皮提取物可以通過促進哮喘模型小鼠CD4+、CD25+T細胞的產(chǎn)生以及抑制Th2細胞炎性因子分泌來發(fā)揮平喘作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)桑白皮中提取的總黃酮可以明顯緩解哮喘小鼠的氣道炎癥癥狀。在TFCM給藥后,小鼠氣道高反應(yīng)性癥狀減輕,另外肺組織炎性細胞浸潤、黏液分泌、杯狀細胞增生較模型組減少,氣道炎癥反應(yīng)癥狀明顯緩解。同時還觀察到IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin、IgE水平下降,細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、巨噬細胞數(shù)量減少,說明TFCM可以抑制炎性因子、嗜酸性粒細胞趨化因子的產(chǎn)生及炎性細胞的浸潤,從而起到緩解哮喘的作用。此外,哮喘發(fā)生的一個重要病理生理特征就是氣道黏液高分泌。在炎癥和其他因素刺激下,氣道上皮杯狀細胞會產(chǎn)生過度的黏液,而黏蛋白MUC5AC、MUC5B是氣道黏液中的重要黏蛋白,其表達水平的高低可以反映杯狀細胞的增生程度[15-16]。 本研究通過對哮喘小鼠肺組織AB-PAS染色觀察到哮喘小鼠氣道黏液分泌明顯增加,杯狀細胞增生,而在TFCM給藥后,小鼠氣道黏液分泌減少。同時對小鼠BALF中黏蛋白MUC5AC、MUC5B的表達水平測定發(fā)現(xiàn),和正常組相比,哮喘模型組小鼠BALF中黏蛋白表達水平顯著增加,而在TFCM給藥后這2種蛋白表達水平顯著下降。
綜上所述,TFCM可以通過降低過敏性哮喘小鼠氣道高反應(yīng),減少中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞浸潤,下調(diào)IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin水平以及IgE表達水平來緩解氣道炎癥。