周俏苗汪洪林黃海燕許 晶肖美芳龔護民吳棟才

(1.海南省婦女兒童醫(yī)學中心,?？?570000;2.海南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,?？?570000)

子癇前期是妊娠期特有的疾病,據(jù)報道,子癇前期的全球發(fā)病率為2%～8%,約占全世界所有孕產(chǎn)婦死亡人數(shù)的14%,孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一[1-2]。子癇前期一般發(fā)生于孕20周后,起源于胎盤,其特征在于高血壓伴隨母體或胎兒腎、肝、腦、心等多器官系統(tǒng)損害[3-4]。

目前關于子癇前期的主要發(fā)病機制并不清楚,早期多數(shù)學者認為早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)病根源為胎盤[5]。胎盤在進化中形成了很強的侵襲能力,胎盤最重要的細胞是滋養(yǎng)層細胞[6]。滋養(yǎng)細胞是胎盤絨毛的特化細胞,在調節(jié)胚胎發(fā)育中起著至關重要的作用,特別在胎盤植入的孕婦中滋養(yǎng)細胞具有高度增殖和侵襲性[7]。微小RNA(miRNA)是近年來的研究熱點,到目前為止人類中大約有2000多種成熟miRNA被發(fā)現(xiàn)[8]。最新研究發(fā)現(xiàn),miRNA在人類胎盤組織中的表達可影響滋養(yǎng)細胞的侵襲和增殖等生物學功能,從而影響胎盤的正常發(fā)育[9]。比如,Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn),低表達的miR-18a可能通過對其靶基因的調節(jié)而參子癇前期過程。陳靜等[11]人發(fā)現(xiàn)miR-155可以通過下調CYR61而參與子癇前期的發(fā)病過程。miR-124家族最早是Mishima等[12]于2007年從小鼠大腦中提取出來,主要包括miR-124-1、miR-124-2、miR-124-3三個亞型。近年更是發(fā)現(xiàn),miR-124在腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要的作用,可通過靶向基因調控細胞的增殖和侵襲[13]。而在本研究中,我們將探討miR-124-3p與子癇前期的調控機制。子癇前期的發(fā)病機制不是任何單個分子的作用,miRNA通過靶向基因參與滋養(yǎng)細胞侵襲障礙、促進血管內皮損傷等病理過程,促進子癇前期的發(fā)生與發(fā)展[14]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路可以影響細胞的增殖、分化與凋亡等系列細胞過程,根據(jù)目前研究表明,p38MAPK蛋白家族包括 p38α(即 MAPK 14)、p38β、p38γ 和 p38δ 4 種異構體亞型[15]。 最新研究發(fā)現(xiàn),p38MAPK參與子癇前期的發(fā)病[16]。在本研究中,我們將進一步探討miR-124-3p與 MAPK 14對子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲產(chǎn)生影響,希望為子癇前期的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

成年的SPF級SD大鼠(20只雌性、10只雄性)購買于湖南省斯萊克景達實驗動物公司[SCXK(湘)2016-0004],月齡 2～3個月,體重 200～220 g。無菌手術在海南省人民醫(yī)院實驗設施進行[SYXK(瓊)2017-0011]。實驗獲我院倫理委員會審批[2017]7號文件(201707),并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞

HEK293T細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

lipofectamin 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;miR-124-3p的模擬物及對照均購買于Invitrogen;MAPK 14-wt質粒、MAPK 14-mut質粒由廣州銳博生物科技公司合成;Dual-Luciferase Peporter Assay System購自美國Promega公司;實驗所用引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供;BCA購自美國Thermo Fisher公司;本研究所用抗體均購自英國Abcam公司;細胞凋亡試劑盒購自美國R&d Systems公司;Matrigel膠購買于美國BD公司。

倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱購自OLYMPUS奧林巴斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及滋養(yǎng)層細胞的提取

置于恒溫恒濕環(huán)境中分籠飼養(yǎng),自由采食飲水,適應一周。雌性與雄性按2∶1合籠,第2天早上進行分泌物涂片鏡檢,發(fā)現(xiàn)精子則定為妊娠期第1天。將孕鼠隨機分為正常組與模型組,妊娠第10天開始,模型組皮下注射L-NAME 100 mg/(kg·d),正常組注射相同濃度的生理鹽水,至第18天,檢測平均尾動脈收縮壓達到(110.12±5.73)mm/Hg,尿蛋白達到(6.33±0.42)mg/24 h,則視為造模成功。

剖宮產(chǎn)后處死母鼠,取出胎盤,分離出絨毛膜滋養(yǎng)層組織。剪成厚度在3 mm左右的薄片,37℃水浴下用0.25%的胰酶消化3次,每次10 min。3000 r/min離心5 min去沉淀,得到細胞懸液,PBS洗滌2次,用含10%FBS的DMEM/F12重懸細胞,接種于培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察可見上皮樣細胞形態(tài),呈板層狀生長。鑒定為無雜質滋養(yǎng)層細胞后,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進一步培養(yǎng)。細胞傳代后,用第三代細胞滋養(yǎng)細胞轉染。

1.3.2 細胞轉染

本實驗分兩組進行轉染,第一組：Control組(正常對照組)、NC組(子癇前期大鼠滋養(yǎng)層細胞轉染陰性對照組)、miR-124-3pmimic組(子癇前期細胞轉染miR-124-3p過表達組)、miR-26b-3pinhibitor組(子癇前期大鼠滋養(yǎng)層細胞轉染miR-26b-3p抑制物組)。第二組：NC組(子癇前期大鼠滋養(yǎng)層細胞轉染MAPK 14轉染陰性對照)、si-MAPK 14組(子癇前期大鼠滋養(yǎng)層細胞轉染MAPK 14干擾組)、oe-MAPK 14組(子癇前期細胞轉染MAPK 14過表達)。

本實驗使用lipofectamin 2000(Invitrogen)試劑盒進行轉染,轉染序列、目的質粒均于上海吉瑪生物公司合成并購買。按照轉染試劑說明書操作如下：用250μL無血清Opti-MEM(Gibco,美國)培養(yǎng)基分別稀釋5μg目的質粒和5μL Lipofectamine 2000,輕彈混勻。室溫靜置5 min,兩者混合均勻,放置20 min后將100μL混合液加到培養(yǎng)孔中,來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后再用于后續(xù)實驗。

1.3.3 雙熒光素酶報告實驗

生信網(wǎng)站Target Scan分析確認miR-124-3p與MAPK 14存在結合位點,接著用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-124-3p與MAPK 14的靶向調節(jié)調節(jié)作用。HEK293T細胞接種至24孔板,培養(yǎng)24 h,用脂質體轉染法將MAPK 14-wt質粒和MAPK 14-mut質粒分別和miR-124-3pmimic與 miR-NC轉染至HEK293T細胞內,轉染48 h后收集細胞,根據(jù)Dual-Luciferase Peporter Assay System說明書指示(E1910,Promega,美國)檢測螢火蟲熒光素酶活性,以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性作為相對值進行統(tǒng)計分析。

1.3.4 qRT-PCR檢測相關基因的表達

首先采用經(jīng)典的TRIzol(Invitrogen,美國)提取總RNA,紫外分光光度計測定OD260/OD280以及總RNA濃度。Primer Script TMRT reagent Kit將1μg總RNA反轉錄反應獲得cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達。反應條件為：95℃進行2 min初始變性,隨后在95℃變性15 s,60℃退火30 s,最后68℃延伸1 min,擴增35個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_量根據(jù) 2-△△Ct公式計算,GAPDH作為MAPK 14的內參基因,U6作為miR-124-3p的內源性對照。反應中所用的引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列表Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.3.5 Western blot檢測相關蛋白的表達

PBS洗滌2次,加入細胞裂解液,冰上裂解10 min。將裂解后的蛋白吸入EP管內,BCA測蛋白濃度(Thermo Fisher,美國)。 5×Loading Buffer混合煮沸5 min后進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后將蛋白轉移至PVDF膜上,含5%BSA的TBST室溫搖床封閉1 h,TBST洗滌一遍后加入一抗(購買于Abcam公司)包括：MMP-2兔多克隆抗體(1∶2000,ab92536),MMP-9兔單克隆抗體(1∶10000,ab76003),GAPDH兔單克隆抗體(1∶10000,ab181602),4℃振蕩過夜,TBST搖床洗滌3遍,每次15 min。山羊抗兔二抗(ab205718,Abcam)孵育1 h,TBST搖床洗滌3次,每次15 min。將膜上液體瀝干后輕輕放于保鮮膜上,加入ECL發(fā)光液,反應1 min。保鮮膜將 PVDF膜封住,X光膠片曝光。Image J進行灰度掃描,GAPDH為內參進行,用目標條帶與GAPDH條帶的灰度值比值來表示相對蛋白表達量。

1.3.6 MTT檢測細胞增殖

轉染24 h后,取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板(每毫升1×105個細胞),每組6個復孔,培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入10μL MTT溶液(5 mg/mL,購買于上海碧云天生物公司),再于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h,酶標儀測定570 nm處吸光度。

1.3.7 流式檢測細胞凋亡與周期

各組細胞轉染48 h后,用0.25%的胰酶消化收集細胞,PBS洗滌2次。按細胞凋亡試劑盒操作,細胞記數(shù),調整細胞濃度為1×105/mL,用80μL的平衡試劑重懸,接著加入10μL的Annexin V-FITC(10 μg/mL)及10μL的PI(5μg/mL),混勻后室溫孵育15 min,再加入400μL的緩沖液,于流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

同上收集細胞,PBS洗滌2次,3000 r/min離心5 min。取1 mL細胞懸液(細胞濃度約為5×105/mL),離心后用預冷是75%乙醇固定2 h。PBS洗滌1次,細胞篩網(wǎng)過濾一次去細胞團,離心后按說明書(BD,美國)指示,再加入500μL的RNase/PI染色液混勻,室溫避光孵育15 min。上機前4℃保存,于流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.8 Transwell檢測細胞侵襲

孔徑為8μm的Transwell板購買于美國康寧。各組細胞轉染后,胰酶常規(guī)消化,1000 r/min離心5 min,PBS洗滌兩遍。將100μL含有2×104個細胞的懸液接種于預涂有基質凝膠的上室(侵襲實驗前先將100μL稀釋好的Matrigel膠加入上室中,室溫過夜處理)。下室加入500μL完全培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱內24 h。取出Transwell上室,用棉簽棒擦去濾膜上層膠以及細胞,用70%的甲醛快速固定10 min,0.02%結晶紫染色5 min,蒸餾水洗滌2次。隨機取5個視野,顯微觀察染色細胞數(shù)拍照并計算平均值。

圖1 miR-124-3p在正常大鼠與子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中的表達Note.Compared with Normal group,*P＜0.05.Figure 1 Expression of miR-124-3p in placenta of normal and preeclampsia rats

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件(IBM公司,美國)處理。計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間比較用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-124-3p在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞表達

為研究miR-124-3p在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞表達,qRT-PCR檢測miR-124-3p在正常大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞及子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的表達(圖1),結果顯示：與正常大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞相比,子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中miR-124-3p表達明顯增加(P＜0.05)。

2.2 miR-124-3p可影響子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖

圖2 過表達或抑制miR-124-3p后子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖情況Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with NC group,#P＜0.05.Compared with miR-124-3p mimic,&P＜0.05.Figure 2 Proliferation of placental trophoblast cells in preeclampsia rats after overexpression or inhibition of miR-124-3p

在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中轉染miR-124-3pmimic及miR-124-3pinhibitoor,MTT檢測各組細胞增殖情況(圖2),結果發(fā)現(xiàn),與正常大鼠滋養(yǎng)層細胞Control組相比,其余各組子癇前期大鼠滋養(yǎng)層細胞增殖能力明顯降低;同NC組相比,miR-124-3pmimic組細胞增殖能力明顯降低,miR-124-3pinhibitor組增殖能力明顯增強(均P＜0.05)。

2.3 miR-124-3p可影響子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞周期與凋亡

流式檢測細胞周期(圖3A、3B),結果發(fā)現(xiàn),與Control組相比,其余各組細胞G1/G0期細胞的比例明顯上升;與NC組相比,miR-124-3pmimic組G1/G0期細胞的比例明顯上升(P＜0.05);miR-26b-3pinhibitor組 G1/G0期細胞的比例明顯下降(P＜0.05)。

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示(圖3C、3D),結果發(fā)現(xiàn),與Control組相比,其余各組細胞凋亡明顯增加;同NC組相比,miR-124-3pmimic組細胞凋亡明顯增加,miR-124-3pinhibitor組凋亡明顯降低(均P＜0.05)。

2.4 miR-124-3p對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲及相關因子的影響

Transwell分析檢測轉染后細胞的侵襲能力(圖4A、4B)。結果顯示：與Control相比,其余各組細胞侵襲能力均顯著降低;與NC組相比,miR-124-3pmimic組細胞侵襲能力顯著降低,miR-124-3pinhibitor組細胞侵襲能力顯著增加(P＜0.05)。

Western blot檢測侵襲相關因子 MMP-2及MMP-9的蛋白表達(圖4C),結果發(fā)現(xiàn),與Transwell侵襲能力結果一致。與 Control相比,其余各組MMP-2及MMP-9表達均顯著降低;與NC組相比,miR-124-3pmimic組MMP-2及MMP-9表達顯著下調,miR-124-3pinhibitor組MMP-2及MMP-9表達顯著上調(P＜0.05)。

2.5 MAPK 14在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中低表達,且miR-124-3p靶向負調控MAPK 14

qRT-PCR檢測MAPK 14在正常大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞及子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的表達(圖5A),結果顯示：與正常大鼠胎盤組織相比,子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中MAPK 14表達明顯下調(P＜0.05)。

網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)miR-124-3p與MAPK 14存在結合位點(圖5B)。雙熒光素酶報告檢測發(fā)現(xiàn)(圖5C),與NC組相比,miR-124-3p與野生型MAPK 14-wt共轉染組中熒光素酶活性強度明顯下降(P＜0.05),與突變型MAPK 14-mut共轉染組的熒光素酶活性強度無明顯差異。

2.6 干擾/過表達MAPK 14對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖與遷移的影響

在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中轉染si-MAPK 14及過表達MAPK 14,MTT檢測各組細胞增殖情況(圖6A),結果發(fā)現(xiàn),同NC組相比,si-MAPK 14組細胞增殖能力明顯降低,oe-MAPK 14組增殖能力明顯增強(均P＜0.05)。

流式檢測細胞凋亡(圖6B),結果發(fā)現(xiàn),同NC組相比,si-MAPK 14組細胞凋亡明顯率上升,oe-MAPK 14組細胞凋亡率明顯下降(均P＜0.05)。

Transwell檢測細胞侵襲能力(圖6C),結果發(fā)現(xiàn)同NC組相比,si-MAPK 14組細胞侵襲能力明顯率下降,oe-MAPK 14組細胞侵襲能力明顯上升(均P＜0.05)。

綜上結果可知,干擾/過表達MAPK 14可模擬miR-124-3pmimic或miR-26b-3pinhibitor的實驗結果。

3 討論

胎盤是胎兒和母體環(huán)境重要的交換界面,胎盤最重要的細胞是滋養(yǎng)層細胞。但其發(fā)育和侵襲過程受到時間和空間的嚴格精細調控,對其調節(jié)失控會導致各種疾病,包括子癇前期[17]。

近年來,miRNA在子癇前期發(fā)病過程中發(fā)揮的作用成為研究熱點,越來越多的研究表明,miRNA參與調控子癇前期的疾病進程[18]。通過Meta分析,有學者發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤組織中差異性表達的miRNA至少有20個,其中11個呈現(xiàn)低表達,9個高表達[9]。劉文娟等[19]進一步發(fā)現(xiàn),子癇前期組胎盤組織中miR-27b的表達水平高于對照組,且重度子癇前期組胎盤組織的miR-27b的表達水平高于輕度子癇前期組。這與本研究結果類似,本研究也發(fā)現(xiàn),與正常大鼠胎盤組織相比,子癇前期大鼠胎盤組織中miR-124-3p表達明顯增加。

圖3 流式檢測細胞周期及細胞凋亡Note.A、B,Cell cycle flow cytometry results and analysis.C、D,Cell apoptosis flow cytometry and results analysis.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with NC group,#P＜0.05.Compared with miR-124-3p mimic,&P＜0.05.Figure 3 Flow cytometry for cell cycle and apoptosis

圖4 子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲情況及相關因子的表達Note.A、B,Transwell analysis was used to detect the invasiveness of trophoblast cells after transfection.C,The expression of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with NC group,#P＜0.05.Compared with miR-124-3p mimic,&P＜0.05.Figure 4 Invasion of placental trophoblasts and expression of related factors in preeclampsia rats

圖5 miR-124-3p與MAPK 14具有靶向結合關系Note.A,MAPK 14 was low expressed in placental trophoblast cells of preeclampsia rats.Compared with Normal group,*P＜0.05.B,The binding sites between miR-124-3p and MAPK 14 were predicted and analyzed by the website.C,The target relationship between miR-124-3p and MAPK 14 was verified by the double Luciferase Report experiment.Compared with miR-NC group,*P＜0.05.Figure 5 miR-124-3p has a targeted binding relationship with MAPK 14

圖6 干擾/過表達MAPK 14對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖與遷移的影響Note.A,MTT was used to detect the proliferation of cells in each group after overexpression/interference of MAPK 14.B,Flow cytometry was used to detect the apoptosis of cells in each group and the statistical analysis chart.C,Transwell was used to detect the invasiveness in microphotography and result analysis.Compared with NCgroup,*P＜0.05.Compared with si-MAPK 14 group,#P＜0.05.Figure 6 Effect of interference/overexpression of MAPK 14 on proliferation and migration of placental trophoblasts in preeclampsia rats

miRNA通過結合靶基因 mRNA的3′UTR直接調控蛋白質的翻譯表達,調控細胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學過程[20]。在本實驗中,網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)miR-124-3p與MAPK 14存在結合位點,且MAPK 14在子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中低表達,miR-124-3p靶向負調控MAPK 14。過往研究證實,miR-124-3p是腦組織中表達最為豐富的miRNA,其表達失調與腫瘤發(fā)生有關[21]。由于滋養(yǎng)層細胞增殖、侵襲等生物學功能與腫瘤細胞有極大的相似性,因此推測miR-124-3p可通過靶向基因影響滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲等功能。

滋養(yǎng)層細胞可分化成具有類似腫瘤細胞的高侵襲能力的絨毛外滋養(yǎng)層細胞,其具有的侵襲性可侵入子宮內膜將胎盤錨定在子宮,協(xié)助胎盤重鑄血管,為胎兒發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質和氧氣,保證胎兒的正常發(fā)育和生長[22]。而子癇前期與miRNA的作用機制在于通過靶基因參與妊娠滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲,具體來說參與滋養(yǎng)細胞侵襲障礙以及調節(jié)血管生成因子,促進血管內皮損傷[23]。比如之前研究發(fā)現(xiàn),miR-210通過抑制其靶分子-受體酪氨酸激酶配體(EFNA3)和 HOMEOBOX-19的表達,降低滋養(yǎng)細胞侵襲性,抑制滋養(yǎng)細胞的遷移和浸潤[24]。過往眾多研究已證實了p38MAPK在子癇前期的作用[25-26],氧化應激產(chǎn)物,激活p38MAPK的磷酸化,還可以通過調節(jié)鈣離子泵,使血管內皮細胞內鈣離子濃度超負荷,導致血管平衡紊亂,引發(fā)內皮細胞損傷和功能障礙,影響胎盤淺著床,導致重度子癇前期的發(fā)生[27-28]。在本次研究中,我們進一步發(fā)現(xiàn),miR-124-3p可靶向負調控MAPK 14,對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲產(chǎn)生影響。

綜上所述,miR-124-3p在子癇前期大鼠胎盤組織中高表達,MAPK 14低表達。miR-124-3p可靶向負調控MAPK 14,對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲產(chǎn)生影響。不過子癇前期的病因復雜,可能與血管、遺傳、胎盤缺血缺氧、免疫或環(huán)境等多種因素參有關,本文僅從胎盤角度揭示子癇前期的發(fā)生發(fā)展,未來希望可從其他角度進行探索,進一步為子癇前期的預防與治療提供思路。