劉小花徐 鵬張昕薇歐陽(yáng)婷吉衛(wèi)龍劉曉慧任林柱

(吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130062)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬中的一員,為緊密的球形無(wú)包膜單鏈環(huán)狀DNA病毒。根據(jù)基因組特點(diǎn),可將PCV分為 PCV1型(porcine circovirus 1,PCV1)、2型(porcine circovirus 2,PCV2)和3型(porcine circovirus 3,PCV3)[1]。對(duì)PCV的研究初期,我們普遍以為這類病毒只能寄生在豬體或豬源細(xì)胞中。但隨著科研人員的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在非洲綠猴腎細(xì)胞及其他細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了PCV的寄生,并且能夠進(jìn)行分離與傳代[2]。PCV2與PCV1不同,它能夠引起豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)或豬圓環(huán)相關(guān)病毒病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)[2-3]。突出表現(xiàn)在豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory diseases complex,PRDC)和母豬繁殖障礙(Reproductive failure)等疾病中,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

PCV2感染會(huì)引起豬源細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)改變,這些信號(hào)包括PCV2增殖、細(xì)胞凋亡和自噬的啟動(dòng)以及抗病毒應(yīng)答的誘導(dǎo)。已有研究發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)可作為抗病毒效應(yīng)的靶標(biāo)[3]。研究發(fā)現(xiàn),PCV1能夠感染人源細(xì)胞,且能夠引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變[4-5],但PCV2是否也能感染人源細(xì)胞的問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。Hattermann等人[6]在2004年用帶有 PCV2全長(zhǎng)的質(zhì)粒感染293T、HeLa等人源細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)在所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞中都擴(kuò)增出了PCV2的DNA,并且發(fā)現(xiàn)了病毒抗原的表達(dá);隨后,轉(zhuǎn)染3 d后的細(xì)胞出現(xiàn)病變,細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形,上清液中死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片數(shù)量增加,但在兩周之后,病毒顆粒消失,證明PCV2不能在人的細(xì)胞中穩(wěn)定存在[6]。往后其他研究人員的調(diào)查顯示,沒(méi)有證據(jù)表明PCV2接觸者的血清中存在PCV2特異性抗體,表明PCV2在人類細(xì)胞是有限存在[7-9]。直至2019年,我們用PCV2感染12種人的細(xì)胞,包括單核細(xì)胞、上皮以及成纖維細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2都能夠穩(wěn)定感染這些細(xì)胞,且產(chǎn)生可感染性的病毒粒子[10]。但關(guān)于人源細(xì)胞感染PCV2之后所引起的免疫反應(yīng)及抗病毒效應(yīng)知之甚少。

RNA-seq技術(shù)是近些年發(fā)展較快的一種高通量測(cè)序技術(shù),具有測(cè)序量大且快速、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)[11]。本文通過(guò)PCV2感染HeLa細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)做進(jìn)一步分析,預(yù)測(cè)其相關(guān)的信號(hào)通路以及生物學(xué)功能,最后篩選出與抗病毒反應(yīng)相關(guān)的基因,并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證,以期為人源細(xì)胞對(duì)PCV2及其他病毒產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PCV2株CC1(GenBank登錄號(hào)JQ955679)是從患有PMWS癥狀的豬組織標(biāo)本中分離得到,并由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及儲(chǔ)存[12]。人源細(xì)胞系MCF-7、HeLa和A549購(gòu)自上海通威生物科技公司[10]。

1.2 主要試劑與儀器

TRNzol-A+試劑(天根生化科技有限公司,中國(guó)北京);Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA);TruSeq鏈mRNA LT樣品制備試劑盒(Illumina,San Diego,CA,USA);磁性寡糖(dT)珠(Anchored oligo(dT)23primers,Sigma);Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)(Illumina,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA制備與RNA序列測(cè)定

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),接毒前1 d分板,待MCF-7、HeLa和A549細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%時(shí),用感染復(fù)數(shù)為1的PCV2株CC1毒液感染細(xì)胞,1 h后棄掉病毒液,用新鮮培養(yǎng)液輕輕洗滌1～2遍,然后加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),未感染組同期進(jìn)行,72 h后用TRNzol-A+試劑提取 RNA?？?RNA溶于50μL去 RNase的ddH2O中,并在-20℃下保存。

為制備cDNA文庫(kù),用去RNase的DNaseⅠ處理總RNA,然后用磁性寡糖(dT)珠純化mRNA,并用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA完整性。RNA完整性指數(shù)(RINs)＞8的可進(jìn)行后續(xù)分析。純化的mRNA用TruSeq鏈mRNA LT樣品制備試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。然后,在Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)上對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 差異基因的功能注釋與富集分析

利用Blast2 GO軟件將所有的UniGenes比對(duì)到各大平臺(tái)的數(shù)據(jù)庫(kù)中,最后在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)可注釋到最大的比對(duì)率。再將測(cè)序獲得的所有DEGs進(jìn)行基因功能注釋(Gene Ontology,GO)分析和分類,獲得轉(zhuǎn)錄本的GO功能注釋信息。DEGs比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)后,獲得 GO條目(term)。通過(guò)超幾何檢驗(yàn)(Phyper),將校正P值(correctedP-value)＜0.05的GO term定義為DEGs中顯著富集的GO term。將DEGs應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto The Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其參與的代謝途徑(correctedP-value≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn))。再利用分子相互作用分析軟件(STRING)預(yù)測(cè)DEGs相互作用網(wǎng)絡(luò),用 Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3 定量PCR分析基因表達(dá)

獲得PCV2感染72 h以及未感染細(xì)胞的總RNA后,并用FastQuant RT-Kit(天根生化科技有限公司,中國(guó)北京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所得cDNA用Bio-Rad IQTM多色實(shí)時(shí) PCR檢測(cè)系統(tǒng)和 Luna?Universal qPCR Master Mix(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室,美國(guó))進(jìn)行SYBR Green定量實(shí)時(shí)PCR。

擴(kuò)增20μL體系,上下游引物各0.5μL,cDNA 2μL,2×Luna通用 qPCR混合物 10μL,ddH2O 7μL,采用以下循環(huán)條件：95℃預(yù)變性60 s,95℃變性15 s,并在60℃下退火而后延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PCV2感染人源細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

本研究利用Illumina HiSeq平臺(tái)共測(cè)了2組樣品(每組樣品有三個(gè)重復(fù)),每組樣品平均有6.40 Gb的數(shù)據(jù)。共檢測(cè)到表達(dá)的基因數(shù)為15402個(gè),其中已知基因14817個(gè),預(yù)測(cè)新基因有585個(gè)。

對(duì)感染72 h及未感染PCV2的HeLa細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組RNA序列分析,結(jié)果如表1所示。在感染PCV2的HeLa細(xì)胞中共鑒定出387個(gè)DEGs,包括267個(gè)上調(diào)基因和120個(gè)下調(diào)基因(表1,圖1A)。在387個(gè)DEGs中,291個(gè)基因與生物過(guò)程有關(guān)。因此,選取生物過(guò)程(biological process)的差異基因做進(jìn)一步GO分類分析。結(jié)果顯示共有212個(gè)基因上調(diào),79個(gè)基因下調(diào)。此外,調(diào)控基因可分為15個(gè)功能組別(圖1B、1C),表明PCV2感染可上調(diào)或下調(diào)多種人類基因。在上調(diào)基因中,占比前四的組別分別是生物調(diào)控(biological regulation)、刺激應(yīng)答(response to stimulus)、細(xì)胞過(guò)程(cellular process)以及代謝過(guò)程(metabolic process),分別占上調(diào)基因總數(shù)的15%、11%、10.8%和10.7%(圖1B)。在下調(diào)基因中,同樣是生物調(diào)控、刺激應(yīng)答、細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程這幾個(gè)功能組別占比較高,分別為16.9%、8.7%、17.2%和10.6%(圖1C)。

2.2 PCV2感染細(xì)胞中DEGs的GO和KEGG途徑富集分析

為了了解DEGs在PCV2感染細(xì)胞中的主要途徑,我們進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析,并預(yù)測(cè)了DEGs可能參與的生物學(xué)相互作用。GO富集結(jié)果表明,最常見(jiàn)的GO term是應(yīng)激反應(yīng)(97 DEGs)和免疫系統(tǒng)過(guò)程(80 DEGs)(圖2A)。

此外,將DEGs進(jìn)行KEGG通路分析以進(jìn)一步評(píng)估它們各自的功能。圖2B展示了PCV2感染的人類細(xì)胞中的前20個(gè)(按Q value從小到大排序)富集途徑。在HeLa細(xì)胞對(duì)PCV2感染的應(yīng)答中,NOD樣受體信號(hào)途徑(NOD-like receptor signaling pathway)有21個(gè)DEGs,單純皰疹病毒感染(Herpes simplex infection)相關(guān)的途徑中有22個(gè)DEGs被高度富集(圖2B)。

2.3 參與PCV2感染的DEGs相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析

利用 Cytoscape軟件(http：//www.cytoscape.org/,Version 3.6.1)的生物網(wǎng)絡(luò)基因功能注釋插件(Biological Networks Gene Ontology,BinGo)對(duì)基因的GO注釋進(jìn)行了超幾何檢驗(yàn),P＜0.001。如圖3A所示,DEGs在炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)(response to cytokine stimulus)、白細(xì)胞趨化性(leukocyte chemotaxis)、免疫應(yīng)答(immune response)和病毒應(yīng)答(response to virus)等生物過(guò)程中高度富集,表明這些生物過(guò)程與PCV2感染人類細(xì)胞的過(guò)程有關(guān)。

表1 RNA-Seq數(shù)據(jù)匯總Table 1 Summary of RNA-Seq data

圖1 PCV2感染與未感染細(xì)胞基因差異表達(dá)分析Note.A,Volcano plot of DEGs.Significantly DEGs were highlighted in blue and red dot.B-C,Categories of the up-regulated genes(B)and the down-regulated genes(C).Figure 1 Differential expression analyses of human genes between mock and PCV2-infected cells

圖2 PCV2感染與未感染的HeLa細(xì)胞中GO富集的前20個(gè)生物過(guò)程N(yùn)ote.A,GO enrichment analysis.B,KEGG enrichment analysis.Circles indicate numbers of enriched genes and colors mean the Q value.Figure 2 Top 20 of GO terms between mock and PCV2-infected human cells

此外,利用STRING網(wǎng)站分析了與病毒應(yīng)答相關(guān)的DEGs潛在的相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖3B所示,24個(gè)DEGs在PCV2感染后下調(diào),包括 IRF9、IFI44L、DDX58、GBP1、GBP3、IFIT2、IFIT1、IFIT3、IL6、IRF1、IRF7、LGALS9、MX1、MX2、OAS1、OAS2、PLSCR1、DDX60、CCL5、 IFIH1(MDA5)、 DHX58(LGP2)、ZC3H12 A(MCPIP)、RSAD2和 ISG15(圖 3B)。

2.4 實(shí)時(shí)qPCR對(duì)DEGs的確認(rèn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述RNA-Seq數(shù)據(jù),選擇了部分與病毒應(yīng)答相關(guān)的屬于刺激應(yīng)答過(guò)程的DEGs,使用實(shí)時(shí)qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4A所示,與未感染細(xì)胞相比,細(xì)胞感染PCV2之后,所選擇的所有DEGs顯著下調(diào),但與RNA-Seq數(shù)據(jù)結(jié)果相反。

根據(jù)免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)、信號(hào)(signaling)和刺激應(yīng)答(response to stimulus)三個(gè)生物學(xué)過(guò)程的GO富集,選擇了在PCV2感染HeLa后差異最顯著的前12個(gè)DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,并以MCF-7細(xì)胞做相同處理進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。如圖4B所示,在感染PCV2的HeLa細(xì)胞中,F8A2的表達(dá)沒(méi)有差異(FC＜1.5);然而,CXCL3、CSF3、TNFAIP3和 ITGB2的表達(dá)水平明顯升高,HIST1H2AK、CXCL1、FBXO17、HBA1、SAA1、PTX3和PI3的表達(dá)水平明顯降低(圖4B)。此外,感染PCV2的 MCF-7細(xì)胞中 HIST1H2AK、FBXO17、PTX3和PI3的表達(dá)水平同HeLa細(xì)胞一致,也明顯降低,而其他基因 F8A2、CXCL1、HBA1、CXCL3、CSF3、SAA1、ITGB2和TNFAIP3的表達(dá)水平明顯高于未感染細(xì)胞(圖4C)。這些結(jié)果表明,不同人源細(xì)胞的抗病毒作用(特別是對(duì)病毒的應(yīng)答)不盡相同。

為了進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果,用PCV2感染A549細(xì)胞72 h,隨機(jī)選擇前文中提到的DEGs做進(jìn)一步實(shí)時(shí)qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,病毒感染A549細(xì)胞后,SAA1、HIST1H2AK、PI3、F8A2、CXCL1、IL-6 和IFI44 L水平較未感染細(xì)胞明顯降低,與HeLa細(xì)胞相比,除F8A2結(jié)果不一致之外,其他基因變化趨勢(shì)均相同。

3 討論

PCV2對(duì)豬源細(xì)胞的易感性,對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅,但該病毒是否存在公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)是目前首要關(guān)心的問(wèn)題。隨著以豬源器官為重點(diǎn)對(duì)象的異種移植技術(shù)的不斷興起與日趨成熟,PCV2能否感染人源細(xì)胞成為飽受爭(zhēng)議且需亟待解決的問(wèn)題[2]。我們之前的研究中初步證明PCV2能夠感染人源細(xì)胞[10],這對(duì)于接觸此病毒的研究人員以及接受器官移植的患者來(lái)說(shuō)都是一個(gè)非常大的安全隱患。除了對(duì)PCV2的防控措施做好之外,研究其抗病毒效應(yīng)也顯得極為重要。

圖4 qRT-PCR結(jié)果Note.A,The results of Real-time PCR of related DEGs from response to virus.B-C,DEGs of the immune system process,signal and response to stimulus.D,Randomly selected some related DEGs from the infect A549 cells.Normalized with GAPDH,the celluar mRNA standardization was 1.0,***P＜0.001 or FC≥1.5 was considered as the significance.Figure 4 The results of qRT-PCR

在本次研究中,選用HeLa細(xì)胞作為轉(zhuǎn)錄組分析的對(duì)象。在感染PCV2之后,使用Illumina HiSeq平臺(tái)一共測(cè)了 2個(gè)樣品,共注釋到 15402個(gè)UniGenes。感染PCV2之后有387個(gè)差異表達(dá)基因,267個(gè)上調(diào)基因和120個(gè)下調(diào)基因。Gene Ontology分為分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過(guò)程(biological process)三大功能類。根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行功能分類。本研究主要選取生物過(guò)程做進(jìn)一步分析。上調(diào)基因集中于生物調(diào)控(biological regulation),而下調(diào)基因集中于細(xì)胞過(guò)程(cellular process)。對(duì)291個(gè)生物過(guò)程有關(guān)的差異基因做進(jìn)一步GO富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),應(yīng)激反應(yīng)(97/291 DEGs)和免疫系統(tǒng)過(guò)程(80/291 DEGs)占比最高,表明在感染病毒之后可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞調(diào)控免疫因子來(lái)產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)的。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)最富集顯著的兩條途徑是NOD樣受體信號(hào)途徑(21/170 DEGs)和單純皰疹病毒感染(22/170 DEGs)。用BinGo插件對(duì)生物過(guò)程所有差異基因的GO注釋進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其中對(duì)病毒應(yīng)答(response to virus)的差異表達(dá)基因被高度富集,而這個(gè)過(guò)程的基因多數(shù)都與抗病毒研究相關(guān)。繼而對(duì)其中24個(gè)已知的DEGs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),結(jié)果顯示這些病毒應(yīng)答相關(guān)基因在感染之后全部下調(diào)。這與RNA-seq結(jié)果分析是相反的,實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次,結(jié)果較為可信,差異原因可能是由于RNA-seq是大規(guī)模篩選的,反映的是樣本整體的基因表達(dá)變化趨勢(shì),所以存在一些基因與qPCR的結(jié)果不一致,需要挑選大量的基因驗(yàn)證。所以又在不同的細(xì)胞中選取了另外一些與免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)、信號(hào)(signaling)和刺激應(yīng)答(response to stimulus)三個(gè)生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因做進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明,PCV2感染可調(diào)節(jié)人源細(xì)胞基因的表達(dá),雖然不同細(xì)胞各基因變化有差異,但大致趨勢(shì)相同,與RNA-seq結(jié)果有一些出入,這在其他一些研究中也出現(xiàn)過(guò)[13-14],其原因可能是由于Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序雖然比較精準(zhǔn),但存在識(shí)別序列通常較短,有一定的錯(cuò)誤率從而會(huì)出現(xiàn)較高假陽(yáng)性的問(wèn)題[15]。

在預(yù)測(cè)的病毒應(yīng)答相關(guān)基因中,變化差別較大的基因有：人粘液病毒抗性2(human myxovirus resistance 2,MX2/MXB)、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白 1/3(guanylate binding protein 1/3,GBP1/3)、四磷酸肽重復(fù)序列1(tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)、維甲酸誘導(dǎo)基因-I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I/DDX58)以及干擾素誘導(dǎo)的44樣蛋白(interferoninduced protein 44-like,IFI44L)。大量文獻(xiàn)報(bào)道,上述基因均是與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)或細(xì)胞增殖密切相關(guān)的。例如,Mx2在感染細(xì)胞中與HIV-1相互作用,并在逆轉(zhuǎn)錄和組裝成完整病毒基因組過(guò)程的早期階段阻斷感染[16-18]。GBP1是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的新靶基因,在體內(nèi)可促進(jìn)GBM腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲,但在體外對(duì)GBM細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響[19-20]。另外,GBP3通過(guò)抑制病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制參與抗流感活性[21]。在表達(dá)IFIT1的細(xì)胞中觀察到較高水平的Ⅰ型干擾素(type I interferon,I-IFN),IFIT1能感應(yīng)到RNA的甲基化狀態(tài),并通過(guò)與缺乏2′-O甲基化的5′帽結(jié)構(gòu)結(jié)合而抑制病毒[22],也能通過(guò)抑制翻譯起始的步驟發(fā)揮其抗病毒功能[23-24]。RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)基因5(Melanomadifferentiation-associated gene 5,MDA5)是作為RNA病毒限制因子的胞漿RNA解旋酶,有研究證明了RIG-I樣受體(The RIG-I-like receptors,RLRs)限制了卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcomaassociated herpesvirus,KSHV)的裂解再活化[25];Dvorak等人[26]用PCV2感染豬源間充質(zhì)樣細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞主要通過(guò)RIG-I/MDA5通路產(chǎn)生大量的I-IFN來(lái)達(dá)到抗病毒應(yīng)答的效果。IFI44L是I型干擾素刺激基因(type I interferon-stimulated gene,ISG),屬于IFI44家族[27],經(jīng)IL-28A和IFN-a處理抑制細(xì)胞丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)復(fù)制后,IFI44L表達(dá)顯著增加[28]。但是,由于PCV2在感染豬源細(xì)胞的過(guò)程中具有免疫抑制作用[29-30],而病毒應(yīng)答過(guò)程中的一些基因大多參與了免疫應(yīng)答過(guò)程(如 ISG15、IL6、IRF1等),因此,推測(cè)PCV2感染人源細(xì)胞也可能具有免疫抑制作用或抑制相關(guān)抗病毒因子表達(dá)的作用,最終導(dǎo)致上述基因的mRNA水平在感染72 h后降低,但這些推測(cè)還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

總之,用PCV2感染宮頸癌細(xì)胞HeLa之后引起細(xì)胞內(nèi)大量基因表達(dá)情況改變,利用RAN-seq技術(shù)系統(tǒng)性分析了胞內(nèi)mRNA的差異變化,多數(shù)DEGs參與了免疫系統(tǒng)過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)以及免疫應(yīng)答過(guò)程。本文著重檢測(cè)了與病毒應(yīng)答以及免疫系統(tǒng)過(guò)程等相關(guān)的DEGs的mRNA水平變化,這些DEGs可能與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)或致病機(jī)制有關(guān)。目前,正在以這些基因編碼的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,分析其在感染PCV2之后的活性及功能變化以及這些蛋白對(duì)PCV2和其他病毒感染的影響。