姚 益，曾小飛，李 衛(wèi)，姚中山，賈維坤

肺癌是發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤，其中85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1]。大多數(shù)肺癌患者就診時腫瘤已發(fā)展為中晚期[2]，5年生存率僅為19.7%，其術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是兩個最具挑戰(zhàn)性的障礙[3]。然而，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖是多種抑癌基因及癌基因共同參與的病理過程[4]。本實驗分析NSCLC中G蛋白偶聯(lián)受體120(G-protein coupled receptor 120, GPR120)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factorm, VEGF)的表達及與預后的關系，旨在尋找預測NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及預后的分子標志物，初步探討NSCLC的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移機制，有助于提前選擇肺癌患者的綜合治療策略和進一步改善NSCLC患者的生存率。

1 材料與方法

1.1 臨床資料(1)收集2017年6月～2019年10月成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸心外科行肺癌根治術的42例新鮮肺癌組織及對應的癌旁肺組織(距離腫瘤邊緣>2 cm)，均經(jīng)病理學明確診斷。(2)另收集病理科2017年1月～2019年6月存檔的85例NSCLC石蠟切塊及62例對應癌旁正常肺組織。85例NSCLC中男性57例，女性28例；年齡36～79歲，平均61.9歲；腫瘤直徑≥5 cm者30例，腫瘤直徑<5 cm者55例；其中腺癌48例，鱗癌26例，其他類型11例；中+高分化56例，低+未分化29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者32例；遠處轉(zhuǎn)移14例；TNM分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期15例，Ⅲ期21例，Ⅳ期14例。隨訪采用查閱患者復查資料結(jié)合電話方式進行，隨訪時間6～36個月，隨訪截止時間2019年12月31日，失訪者隨訪時間按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.2 主要試劑總RNA提取試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自索萊寶生物公司；Anti-GPCR GPR120抗體(ab230869)購自美國Abcam Biochemicals公司；Anti-VEGF購自武漢三鷹生物公司。

1.3 方法

1.3.1qPCR 對42例新鮮NSCLC腫瘤組織和癌旁組織樣本進行qPCR分析。進行總RNA提取并進一步行qPCR分析，比較配對的兩組間差異；同時繪制散點圖，分析GPR120與VEGF mRNA表達的相關性。GPR120正向引物5′-TTGAACTTCTTGGT GCCAGGACTG-3′，反向引物5′-CCGTGAGCCTCTTC CTTGATGC-3′。VEGF正向引物5′-TGCAATGGAT CAAGGACCAGAGG-3′，反向引物5′-TGCAGCCAG CAAGAAGCATCAG-3′。標準化基準物為β-actin，其正向引物5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′，反向引物5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化SP法進行檢測,一抗GPR120、VEGF的稀釋濃度為1∶100。免疫組化結(jié)果判定：按陽性細胞染色強度評分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞0～20%為1分，21%～50%為2分，51%～100%為3分。兩項評分結(jié)果相乘作為最終得分：<4分為低表達或不表達，而≥4分為高表達。

1.3.3Western blot檢測 分別將收集的NSCLC與癌旁組織樣本進行充分裂解，并采用BCA法進行總蛋白濃度的測定，將蛋白樣本進行等量上樣，上樣量為10 μL，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以脫脂奶粉封閉1 h。而后加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌后顯色、定影，使用凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)觀察。并對GPR120、VEGF蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC新鮮標本中GPR120、VEGF的表達對42例新鮮NSCLC腫瘤組織和癌旁組織行qPCR及Western blot檢測GPR120、VEGF mRNA及蛋白的表達。結(jié)果表明，NSCLC中GPR120 mRNA在癌組織中和對應癌旁組織的相對表達量分別為1.82±0.58和1.32±0.58(t=5.219，P<0.001)；VEGF mRNA在癌組織和對應癌旁組織中的相對表達量分別為1.73±0.43和0.95±0.35(t=8.900，P<0.000 1，圖1)。NSCLC腫瘤組織GPR120蛋白條帶的灰度比值(1.41±0.55)比對應癌旁組織(1.00±0.28)高(t=4.492，P<0.001)；VEGF蛋白條帶的灰度比值(1.58±0.76)比對應癌旁組織(1.01±0.23)高(t=4.990，P<0.001)，且GPR120、VEGF蛋白表達量隨著腫瘤TNM分期越晚表達具有上升趨勢(圖2)。NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF mRNA及蛋白的表達明顯高于對應癌旁組織(P<0.001)。通過散點圖分析GPR120與VEGF mRNA表達的相關性結(jié)果顯示，NSCLC癌組織中GPR120、VEGF mRNA表達量呈正性線性相關(r=0.738 6，P<0.000 1)，即隨著NSCLC癌組織中GPR120表達量增加，VEGF mRNA表達量亦隨之增高(圖3)；癌旁正常肺組織中GPR120、VEGF mRNA表達量呈負性線性相關，即NSCLC癌旁正常組織中GPR120、VEGF mRNA表達無特定規(guī)律可循(r=-0.0743 0，P=0.640 0，圖3)。

2.2 NSCLC石蠟組織中GPR120、VEGF的表達免疫組化顯示GPR120、VEGF在NSCLC及其對應正常組織中均定位于細胞膜及細胞質(zhì)(圖4、5)。85例NSCLC石蠟樣本中有50例(58.82%)觀察到GPR120高表達，52例(61.18%)VEGF高表達，而在與之匹配的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期共62例腫瘤鄰近組織樣本中有14例GPR120高表達(22.58%)，10例(16.13%)VEGF高表達。NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF表達明顯高于癌旁組織(P<0.05)。

2.3 GPR120、VEGF表達的相關性及與NSCLC臨床病理特征的關系在85例NSCLC組織中，GPR120、VEGF共同高表達39例，共同低表達22例。采用Spearman等級相關檢驗結(jié)果表明GPR120與VEGF表達呈顯著強相關(r=0.413，P<0.001)。NSCLC中GPR120蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(P<0.05)；VEGF蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(P<0.05，表1)。

2.4 GPR120、VEGF表達與NSCLC患者生存期的關系85例NSCLC患者隨訪時間3～36個月，中位隨訪時間27個月。分別建立Kaplan-Meier生存模型曲線，采用Log-rank檢驗進行分析：GPR120、VEGF蛋白高表達患者比低表達患者預后水平差，累積存活時間低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GPR120、VEGF同時高表達患者與兩者同時低表達及GPR120或VEGF僅有一種高表達患者相比預后水平差，累積存活時間相對較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

2.5 影響NSCLC患者預后的多因素Cox比例風險回歸建立Cox比例風險回歸模型，仍以本組85例NSCLC為樣本，以預后狀況為應變量，賦值0=生存，1=死亡。Cox回歸模型多變量分析發(fā)現(xiàn)，85例NSCLC患者的總生存率與多種因素相關，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017)、遠處轉(zhuǎn)移(P=0.007)、GPR120蛋白高表達(P=0.027)為NSCLC患者預后的危險因素(表2)。

圖1 NSCLC癌組織及癌旁正常組織中GPR120(A)、VEGF(B)mRNA的表達

圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC腫瘤組織及對應癌旁組織中GPR120(A)、VEGF(B)蛋白的表達：N.癌旁正常組織；Ca.癌組織

圖3 A.NSCLC癌組織中GPR120與VEGF mRNA表達散點圖；B.癌旁正常肺組織中GPR120與VEGF mRNA表達散點圖

表1 NSCLC中GPR120、VEGF表達與臨床病理特征的關系

④A④B④C⑤A⑤B⑤C

圖6 A.GPR120表達和NSCLC患者預后的關系；B.VEGF表達和NSCLC患者預后的關系；C.GPR120、VEGF不同表達狀態(tài)與NSCLC患者預后的關系

3 討論

肺癌患者的5年生存率低，其中一項重要原因是患者就診時腫瘤已為中晚期，表現(xiàn)出明顯的侵襲轉(zhuǎn)移特征[3]。然而，腫瘤的侵襲遷移、增殖的產(chǎn)生是多種抑癌基因及癌基因共同參與的病理過程[4]。新近發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族重要成員GPR120與部分惡性腫瘤關系密切，然而其作用及參與機制尚不清楚，可在不同腫瘤中或即使同一腫瘤的不同細胞系表現(xiàn)出相反的作用，且在肺癌中的研究較少[5-8]。VEGF在腫瘤中的作用研究一直為一個熱門方向，其檢測在NSCLC的診斷、治療、預后評估等方面具有重要價值[9-11]。目前以VEGF為靶點治療NSCLC的抗血管生成藥物貝伐珠單抗在我國獲批用于臨床治療晚期NSCLC。前期Wu等[5,12]對人類結(jié)直腸癌及食管癌研究中發(fā)現(xiàn)GPR120與VEGF表達密切相關。因此，探究GPR120、VEGF在NSCLC中的作用及關系對NSCLC的評估及治療具有一定意義。

表2 影響NSCLC患者預后的Cox比例風險回歸結(jié)果

本實驗采用qPCR、Western blot、免疫組化檢測均發(fā)現(xiàn)，NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF表達高于對應癌旁肺組織，且隨著腫瘤分期越晚表達越高。分析GPR120蛋白表達與臨床病理特征的關系表明：GPR120蛋白高表達與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚之間關系密切。上述結(jié)果提示，GPR120高表達NSCLC患者可能會有更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的臨床分期。這也與結(jié)直腸癌[5]、食管癌[12]、乳腺癌[13]等癌組織中的研究結(jié)果相同。Wu等[5,12]研究表明在人類結(jié)直腸癌組織及食管癌中GPR120表達與腫瘤病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關性。郭文靜[13]亦發(fā)現(xiàn)，GPR120蛋白在乳腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常組織，且與乳腺癌惡性程度呈正相關。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)，NSCLC中VEGF蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關，這與Lin等[10-11]的研究結(jié)果一致。此研究還表明GPR120與VEGF mRNA及蛋白表達顯著相關，兩者之間可能具有共同作用。這些結(jié)果說明GPR120在NSCLC中高表達的同時伴隨著VEGF高表達。Wu等[5,12]在結(jié)直腸癌、食管癌中研究結(jié)果可能解釋其原因，其研究顯示GPR120上調(diào)可通過PI3K/Akt-NF-κB通路上調(diào)VEGF促進結(jié)直腸癌及食管癌血管生成，并參與腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。因此，我們推測在NSCLC中GPR120高表達可使VEGF表達亦上調(diào)，GPR120高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期之間相關可能是VEGF上調(diào)的結(jié)果?？傊?，GPR120、VEGF高表達可使NSCLC患者腫瘤細胞生長、遷移侵襲能力增強，可以向更深、更遠處浸潤轉(zhuǎn)移。本實驗還發(fā)現(xiàn)GPR120、VEGF蛋白表達與患者生存期密切相關，經(jīng)Cox多因素回歸分析也應證了這一點，同樣也應證了GPR120與VEGF的共同作用促進了NSCLC的惡性進展，不利于NSCLC的預后。與Lin等[10]報道VEGF高表達預示不良的預后，具有更短的生存期一致。上述結(jié)果說明GPR120、VEGF表達可促進NSCLC的進展，并影響NSCLC患者的生存期，可以作為判斷NSCLC預后的指標之一。

然而本組檢測GPR120在臨床標本上的表達與Kita等[8]研究肺癌細胞系發(fā)現(xiàn)的GPR120可能抑制肺癌A549細胞的惡性特征結(jié)果相反，分析其可能原因：(1)GPR120涉及的分子機制不同，GPR120在同種腫瘤中涉及到的機制不同可能表現(xiàn)出相反作用[5-6]；(2)GPR40的干擾，正如Kita等[8]研究的結(jié)果一樣，GPR120與GPR40在肺癌細胞中呈現(xiàn)出相反的作用，共同調(diào)節(jié)肺癌的細胞功能。在其他腫瘤中研究結(jié)果亦同樣存在該現(xiàn)象[14]；(3)腫瘤組織中間質(zhì)細胞、免疫細胞對檢測具有一定干擾。

本實驗結(jié)果顯示GPR120與VEGF均在NSCLC中表達上調(diào)，且顯示出共同促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，但其涉及的分子機制還不明確，后期還需進一步明確GPR120與VEGF之間的作用分子機制及調(diào)控關系，為進一步研究GPR120在NSCLC中的具體作用奠定基礎。此外，GPR120及VEGF高表達提示NSCLC患者預后相對較差，Cox分析也進一步證實此結(jié)論。本實驗結(jié)果表明GPR120可能通過VEGF發(fā)揮促癌作用，有望作為新的評估、治療NSCLC的靶點。