張 磊

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，隨著人類生活條件的改善，良好飲食習慣的建立以及幽門螺桿菌的根除，胃癌的發(fā)病率呈下降趨勢。然而，全球胃癌的發(fā)病率及病死率仍居高不下[1]。隨著分子病理學的發(fā)展，對胃癌發(fā)病機制的了解有了長足的進步，但離最終闡明仍相去甚遠。因此，有必要進一步探索并尋找胃癌新型治療靶標，以達到抑制胃癌增殖和轉移，提高患者生存率的目的。上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是轉移的關鍵環(huán)節(jié)，該過程可以促進腫瘤細胞的侵襲和向遠處器官的轉移[2]。在此過程中，細胞經(jīng)歷了形態(tài)學上的變化，上皮細胞失去細胞連接和極性并轉化為具有侵襲與轉移特性的間充質(zhì)細胞[3]。越來越多的證據(jù)表明EMT可引發(fā)細胞遷移/侵襲并導致癌細胞的耐藥性[4-5]。本實驗在組織學與細胞學水平上探討Twist基因對胃癌細胞EMT的意義。

1 材料與方法

1.1 材料小量及中量質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京康為世紀生物公司；內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；DNA Marker、瓊脂糖購自美國Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司；Twist RNAi表達載體、引物設計與合成購自上海生工生物公司；轉染試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；96孔板及Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自Millipore公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株BGC-823購自中國科學院上海細胞生物學研究所，-80 ℃冰箱中保存。細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，細胞匯合度70%～80%時進行傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2Twist小干擾RNA(siRNA)的構建 根據(jù)Genbank中Twist基因(585 bp，NM 000474)的核苷酸序列及siRNA設計原則，針對Twist cDNA編碼區(qū)第861～881位核苷酸進行干擾片段的設計，寡核苷酸兩端分別帶有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，合成序列如下：正義鏈5′-GATCCGATG GCAAGCTGCAGCTATTTCAAGAGAATAGCTGCAGCTTGCCAT CTTTTTTGGAA-3′，反義鏈5′-AGCTTTTGCAAAAAAGATG GCAAGCTGCAGCTATTCTCTTGAAATAGCTGCAGCTTGCCAT CG-3′。連接Psilencer 3.1質(zhì)粒，化入大腸桿菌DH5a中。將連接產(chǎn)物各取4 μL分別接種于100 μL的DH5a感受態(tài)細胞中進行轉化。挑取單個菌落擴增培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提。用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ分別對重組質(zhì)粒進行單酶切鑒定。將鑒定后的Twist siRNA重組質(zhì)粒送上海生工生物公司進行測序。本實驗采用細胞轉染技術，將鑒定成功的Twist小干擾RNA作為干擾組，未轉染組作為對照組，進行后續(xù)實驗分析。

1.2.3總RNA提取 取對數(shù)生長期細胞，用PBS洗滌細胞2～3次，胰酶消化細胞并收集細胞懸液，1 500 r/min離心5 min。棄上清，每(5～10)×106個細胞加入1 mL Trizol試劑后，反復用槍吹打，冰上裂解細胞。將Trizol裂解液轉入無酶EP管中，室溫靜置5 min。按每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，用力震蕩15 s，室溫下放置5 min，12 000g，2～8 ℃離心15 min。吸取上層水相置于新的無酶EP管中，按每1 mL Trizol加500 μL異丙醇的量加入異丙醇，室溫下放置10 min，12 000g，2～8 ℃離心10 min。棄上清，加1 mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7 500g，2～8 ℃離心5 min。棄上清，干燥沉淀的RNA。加入15～20 μL的DEPC水溶解RNA沉淀，-80 ℃冰箱中保存。操作過程均在冰上進行，以防止RNA降解。核酸檢測儀測定RNA的濃度及吸光度OD260/280。

1.2.4qRT-PCR反應 提取BGC-823細胞總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為cDNA。根據(jù)美國Fermentas公司熒光定量PCR試劑盒說明書進行冰上加樣，在PCR儀上進行擴增反應，反應體系如下：10×buffer 2.5 μL、dNTP混合液0.5 μL、cDNA 2.0 μL；上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.3 μL、去離子水18.7 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 40 s退火，72℃ 40 s延伸，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，基因表達產(chǎn)物以2-ΔΔCt計算。每組設置3個復孔，每個實驗重復3次。所需引物序列包括：Twist上游引物5′-GCTCAGCTACGCCTTCTCG-3′，下游引物5′-GATGCCTTTC CTTTCAGTG-3′；E-cadherin上游引物5′-ATCCAAAGCCTCA GGTCATAAACA-3′，下游引物5′-AAGAAACAGCAAGAGCAG CAGAAT-3′；N-cadherin上游引物5′-CCATCAAGCCTGTGG GAATC-3′，下游引物5′-CCCCAGTCGTTCAGGTAATCAT-3′；GAPDH上游引物5′-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

1.2.5劃痕實驗 將細胞接種于96孔板中，密度為每毫升1.5×105個細胞，分別對每組細胞進行處理，37 ℃下孵育過夜。在80%～90%濃度下，用10 μL槍頭劃出一致的劃痕傷口，用PBS洗滌細胞2次，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后通過計算劃痕面積得出細胞遷移率。每組實驗重復3次。

1.2.6Transwell實驗 對Matrigel進行1∶8稀釋，覆蓋在Transwell小室的上室面，37 ℃ 30 min聚集成凝膠。實驗前一天細胞饑餓12～24 h。消化細胞，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1～2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度每毫升5×105個細胞。向下室加入600 μL含30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取1 00 μL細胞懸液加入上室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。取出小室，用棉簽輕輕刮除上室未穿過的細胞。4%多聚甲醛固定20 min后染色。在200倍光鏡下計數(shù)穿透細胞數(shù)，每孔隨機計數(shù)5個視野中的細胞數(shù)。以穿透的細胞數(shù)目表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.7Western blot檢測 消化收集對數(shù)生長期細胞，加入99 μL RIPA裂解液與1 μL PMSF制備細胞裂解物，BCA法測定蛋白濃度。取等量的蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF膜上。條帶置于含5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液中封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。加入二抗37 ℃孵育2 h后，化學發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，Image J v1.8.0測定相對蛋白表達量。

1.2.8臨床病理組織標本 根據(jù)赫爾辛基宣言，收集25例臨床胃癌組織和相鄰的癌旁正常組織(患者術前均未接受過放、化療)均來自皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院(六安市第二人民醫(yī)院)，標本置于-80 ℃液氮中保存。

1.2.9Kaplan-Meier數(shù)據(jù)分析 在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析平臺中檢索Twist基因，限定條件為總生存和無疾病進展生存，并在線繪制Twist表達的生存曲線。

2 結果

2.1 Twist對胃癌組織的影響通過qRT-PCR技術檢測25例胃癌組織標本結果顯示，相對于癌旁組織，Twist在癌組織中表達上升(P<0.05)，且通過Kaplan-Meier Plotter軟件分析得到Twist基因高表達與胃癌患者的預后呈負相關(P<0.05)，說明Twist在胃癌中發(fā)揮癌基因作用，且表達水平越高，患者預后越差(圖1)。

圖1 Twist在胃癌及癌旁組織中的表達及其與預后的關系：A.癌與癌旁組織中Twist表達情況；B.生物信息軟件預測Twist基因表達與胃癌預后的關系

2.2 干擾Twist基因對細胞遷移能力的影響劃痕實驗檢測干擾Twist對細胞遷移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)相比于對照組，干擾組細胞遷移率減低(P<0.05)。提示干擾Twist表達后，細胞遷移能力明顯降低(圖2)。

2.3 Transwell小室檢測各組細胞侵襲能力改變采用Transwell小室檢測各組細胞發(fā)現(xiàn)：相對于對照組，干擾組細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示干擾Twist表達后細胞侵襲能力明顯降低(圖3)。

圖2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力改變

圖3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力改變

2.4 干擾Twist基因EMT相關因子的表達采用qRT-PCR及Western blot法檢測各組中EMT相關因子E-cadherin及N-cadherin在轉錄水平上的變化，與對照組相比，干擾Twist表達后，E-cadherin的相對表達量增高(P<0.01)，而N-cadherin的表達量降低(P<0.05，圖4)。

圖4 qRT-PCR檢測EMT相關指標的表達：A.qRT-PCR檢測E-cadherin mRNA的表達；B.Western blot檢測E-cadherin蛋白的表達；C.qRT-PCR檢測N-cadherin mRNA的表達；D.Western blot檢測N-cadherin蛋白的表達；*P<0.05；**P<0.01

3 討論

胃癌是消化道較常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及多個環(huán)節(jié)、多個步驟[6-7]。以往胃癌的好發(fā)年齡在50歲以上，且男性的發(fā)病率高于女性，但隨著人們生活方式、飲食結構、感染等因素的改變，胃癌的發(fā)生趨于年輕化。近年腫瘤靶向治療成為學術界研究的熱點，也為胃癌的診斷、治療及預后提供了新的方向[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)Twist基因參與胃癌BGC-823細胞的生物學進程，推測其可能是胃癌細胞的新型靶向生物標志物，但具體作用機制仍有待進一步研究。

EMT賦予腫瘤細胞更強的侵襲能力及遷移游走的特性[9]。研究表明miR-33a通過Snail/Slug信號通路抑制胃癌細胞的EMT、侵襲和轉移等過程[10]。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)Twist基因參與形成胃癌細胞的EMT，抑制其在胃癌細胞中的表達有助于逆轉EMT，但關于逆轉EMT的具體機制需要后續(xù)實驗進一步加以驗證。

Twist被認為是EMT過程中的關鍵因子之一。MEST通過STAT3激活導致Twist-1誘導，且通過誘導STAT3核轉位能夠誘導EMT程序的激活[11]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)Twist-1是miR-335的直接靶點且沉默Twist-1基因促進腫瘤細胞凋亡，并逆轉了miR-335抑制誘導的細胞活力增加、遷移、侵襲和EMT相關蛋白的異常表達。此外，國內(nèi)已有文獻報道Twist-1參與形成胃癌細胞EMT。本實驗發(fā)現(xiàn)干擾Twist基因表達后，EMT相關因子E-cadherin表達顯著上調(diào)，而N-cadherin表達明顯下降，說明Twist基因在促進胃癌細胞BGC-823的EMT過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，干擾Twist表達后，細胞的侵襲和轉移能力降低，與前期實驗結果一致。前期實驗證實細胞骨架蛋白F-actin的表達位置在干擾前后并無明顯改變，因此推測在胃癌EMT過程中可能需要其他細胞因子或通道蛋白與Twist共同發(fā)揮作用，至于可能存在的調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的其他關鍵蛋白或信號轉導途徑則有待于進一步研究分析。