古興波，胡小霞，左乾程，黃永光

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；2.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025）

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而制成的飲料酒。中國白酒按香型劃分為：醬香型、濃香型、清香型等主要香型白酒，此外還有米香型、董香型、兼香型、鳳型、特型、豉香型、芝麻香型等，以及近年來發(fā)展興起的清醬香型白酒。造成各香型白酒酒體風格差異的原因，除了與糖化發(fā)酵劑種類、發(fā)酵原料、自然環(huán)境和生產工藝等因素有關外，最根本的原因是發(fā)酵微生物群落結構的不同，因此，研究白酒釀造體系微生物群落結構，有助于認識白酒發(fā)酵過程機理。

起初對釀酒微生物群落結構的研究主要依賴于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)技術手段。研究表明，自然界中99%以上的微生物不能培養(yǎng),使得可培養(yǎng)技術得到的研究結果存在一定的局限性。而宏基因組等技術的發(fā)展與應用避開了微生物分離純培養(yǎng)問題,極大拓展了微生物資源的利用空間,增加獲得新活性物質的機會和途徑。1985 年，PACE 等[1]首次提出可以通過直接從環(huán)境樣品中提取微生物的群體基因組DNA，繞過純培養(yǎng)技術直接對其進行研究，并成功獲得了大量前所未知的微生物信息。1998年，Handelsman 等[2]提出了宏基因組學(metagenome)概念，并將其定義為：一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法，并第一次使用了Metagenomics 這個名詞。宏基因組學又稱元基因組學、環(huán)境(生態(tài))基因組學、群落基因組學，是一種不依賴于人工分離培養(yǎng)的微生物基因組技術。宏基因組技術的發(fā)展，為研究白酒釀造微生物多樣性提供了新的方法和手段,促進了研究者對于釀酒微生物多樣性的認識。本文在介紹宏基因組學技術的基礎上,分析其在白酒釀造領域中的研究及應用情況,旨在為認識白酒的發(fā)酵機理提供理論指導。

1 宏基因組學研究策略

宏基因組學研究的基本策略流程為：樣品和基因(組)的富集；提取特定環(huán)境中的基因組DNA或者RNA；構建宏基因組文庫以篩選目的基因；目的基因活性產物表達。

1.1 環(huán)境樣品及目的基因組富集

對環(huán)境樣品的預富集可以提高目的基因的檢出幾率。目前，預富集技術主要分為細胞水平富集和基因組水平富集。其中，細胞水平富集主要是通過利用選擇培養(yǎng)基對目標微生物進行富集培養(yǎng)，最常用的方法是底物選擇，此外還包括營養(yǎng)選擇及物理化學指標選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群，因此導致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過先在嚴格脅迫條件下短期處理，然后改為較溫和的處理條件，可以在一定程度上克服這種方法的局限性。基因組水平富集常用的技術為穩(wěn)定同位素探針技術(SIP），此外，還有抑制性消減雜交技術、差異顯示技術、噬菌體展示技術、親和捕獲技術及DNA 微陣技術等[3]。

1.2 宏基因組DNA或者RNA的提取

DNA或者RNA的提取是宏基因組學用于微生物群落結構研究的基礎，DNA 或RNA 提取的質量決定了后續(xù)分析的質量。對于不同類型的樣品采用不同的DNA 或者RNA 提取策略。Luna 等[4]在2006 年對海洋沉積樣品采用不同的DNA 提取策略來研究不同的實驗方法對深海微生物多樣性是否有影響，結果證明只采用單一的DNA 提取方法會極大地低估微生物多樣性。此外，對一些特殊的如烴和重金屬含量較高的土壤或者沉積樣品采用表面活性劑或者鰲合劑進行潤洗可以增加DNA 的得率[5]。

宏基因組DNA 或者RNA 的提取方法可分為直接提取法和間接提取法。直接提取法不需要將細胞從樣品中提取出來，所提取的DNA 似乎更能代表樣品的微生物群落，缺點是提取DNA 的同時也提取了樣品中的其他成分，有些成分會干擾后續(xù)實驗。間接提取法是在裂解釋放DNA 之前，先將微生物細胞從它們的環(huán)境基質中分離出來，這一方法的局限主要是很多細菌會吸附在樣品顆粒上不能被分離出來，結果將會導致所反映結果中微生物群落具有片面性[6]。因此，為了確定不同的微生物群落成員在其中可能起到的作用，所選擇的DNA提取方法除了要考慮樣品類型外，還要能夠將游離于細胞外的DNA 以及己經死亡的細胞的DNA 與具有活性的細胞的DNA 區(qū)分開來。Nocker 和Camper[7]通過添加EMA 來去除環(huán)境樣品群落中的死亡細胞中的DNA。

1.3 宏基因組文庫的構建

1.3.1 載體的選擇

載體選擇的原則主要考慮是否有利于目標基因的擴增和表達，以及在篩選細胞毒類物質時表達量的調控等。根據克隆載體的不同，宏基因組文庫可分為質粒文庫、細菌/酵母人工染色體文庫、噬菌體類載體文庫。早期宏基因組文庫主要以質粒載體和大腸桿菌宿主細胞構建而成的小片段(＜15 kb)文庫。該文庫操作簡便、拷貝數高、對DNA 質量要求不高，適合純度低或剪切較嚴重的DNA 模版。但插入片段小，篩選量大，活性比率低，主要適用于分析新的基因序列信息及篩選編碼代謝相關的單一基因或小操縱子。Fosmid 文庫和Cosmid 文庫能容納15～40 kb 的外源DNA，同時己經成功構建了容量高達200～350 kb 外源DNA 的細菌人工染色體文庫和酵母人工染色體文庫。該文庫不僅擁有巨大的插入片段載量，而且穩(wěn)定性好、篩選效率高、克隆表達能力強，可獲得基因簇表達活性物質。主要用于分析某一生境中微生物群落多樣性及篩選由基因簇或多個基因控制表達的活性物質。但其操作較復雜繁瑣、對DNA 純度要求較高，且拷貝數低，擴增較困難。此外，λ-噬菌體和其他病毒也可以作為構建宏基因組克隆文庫的載體[3]。

1.3.2 宿主細胞的選擇

宿主菌株的選擇主要考慮轉化效率、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達、目標性狀(如抗菌)缺陷型等因素。E.coli操作簡單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制，是最常用的宿主細胞。但是由于環(huán)境樣品的總DNA 有很大一部分為真核基因組DNA，其在細菌宿主中往往不能表達，大大限制了這部分基因的篩選。也有報道利用鏈霉菌、假單胞菌等真菌作為受體來鑒定有關新抗生素生物合成的基因，但技術還不成熟。

1.4 宏基因組文庫篩選

1.4.1 序列依賴性篩選法

序列依賴性篩選法是根據文庫中的己知序列或保守序列來設計雜交探針或PCR引物，從宏基因組文庫中篩選目標序列。功能基因PCR 擴增技術是最為常用的序列依賴性篩選法。此外，還有微序列技術(Microarray，又稱基因芯片)和焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術等。序列分析法需要根據已知的基因和基因表達產物的保守序列設計引物和探針，因此，對鑒定新的基因成員有一定的局限性，且PCR 往往只能獲得部分基因的擴增。2014 年，劉小樂等[8]開發(fā)出一種統(tǒng)計方法，被稱為基于模型的全基因組CRISPR/Cas9 敲除分析（MAGeCK），來確定來自于CRISPR/Cas9 篩選的必需sgRNA、基因和通路。Margulies[9]等描述了一個可擴展，高度并行的測序系統(tǒng)microfabricated high-density picolitre reactors，原始吞吐量顯著大于最先進的毛細管電泳儀器。能夠在4 h 運行中以99 %或更好的精確度測序2500 萬個堿基，并開發(fā)了用于DNA 擴增的乳液方法和用于使用針對固體支持物和皮升級體積優(yōu)化的焦磷酸測序方案的通過合成測序的儀器。通過鳥槍測序和從頭組裝的支原體生殖基因組展示這個系統(tǒng)的效用，吞吐量、準確性和魯棒性，96%的覆蓋率在99.96%的精度在一臺機器的運行。由CRISPR/Cas9 技術與單指導RNA（sgRNA）庫介導的陣列遺傳篩選需要高通量平臺，能夠在全基因組規(guī)模高效率地轉染不同的細胞類型，用于檢測和分析復雜的細胞表型。Bian 等[10]開發(fā)了高通量原位細胞電穿孔（HiCEP）微系統(tǒng)。成功地將編碼增強的綠色和紅色熒光蛋白（EGFP 和ERFP）的兩種質粒在169 微孔陣列芯片上電穿孔連接到附著的HeLa細胞中，轉染效率為71.6%±11.4%和62.9%±2.7%，細胞存活率高于95%。并成功地將sgRNA選擇性電穿孔到以高通量方式表達Cas9 核酸酶的293T 細胞中，觀察到由于修復由CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)介導的蛋白質編碼序列而導致的GFP 強度增加4 倍。這項研究證明，這種HiCEP 系統(tǒng)在將來用于難轉染細胞上的全基因組CRISPR 文庫的陣列功能篩選中具有巨大的潛力。

1.4.2 非序列依賴性篩選法

非序列依賴性篩選法，其不依賴于任何己知序列信息，僅根據文庫克隆子產生的活性物質進行篩選。其中，以功能篩選法最為常用，此外還有底物誘導基因表達(SIGEX)法、穩(wěn)定性同位素技術篩選法、熒光原位雜交技術篩選法、基因陷阱技術等。

1.5 宏基因組數據分析

目前，針對微生物群落高通量測序數據分析的軟件主要有Mothur、MEGAN、Qiime、JCoast 以及STAMP。2012 年，李昂[11]開發(fā)了基于Linux 平臺的宏基因組分析軟件MINT。2015 年,李俊鋒[12]開發(fā)了一套完整的16S r RNA 基因測序數據處理流程關于宏基因組測序數據，為僅考慮物種分類和豐度信息的情況建立了一套高效率、高一致性的數據處理流程。2015年，美國Los Alamos國家實驗室的科學家們向人們展示了一套宏基因組分析的新工具-GOTTCHA(Genomic Origins Through Taxonomic CHAllenge)。這一工具能在核酸數據中尋找符合要求的獨特序列，可以對鳥槍法宏基因組學數據進行非常精確的分類，在復雜樣本中進行物種鑒定和相對豐度分析，能夠同時鑒定細菌和病毒序列。GOTTCHA 也被成功用于難以處理的環(huán)境和臨床樣本，表現(xiàn)出超越其他現(xiàn)有方法的卓越性能[13]。2017年，有研究者在Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq 生物信息學分析的現(xiàn)行標準和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNAseq數據分析指南。這份指南覆蓋了RNA-seq數據分析的所有主要步驟，比如質量控制、讀段比對、基因和轉錄本定量、差異性基因表達、功能分析、基因融合檢測、eQTL 圖譜分析等等。此外，他們還介紹了RNA-seq 數據與其他數據類型的整合。這種數據整合可以將基因表達調控與分子生理學和功能基因組學關聯(lián)起來，如今越來越受到研究者的歡迎。

2 宏基因組學在白酒行業(yè)中的研究現(xiàn)狀及應用

2.1 宏基因組學技術應用于發(fā)掘白酒微生物資源

2.1.1 宏基因組技術克隆分離功能基因

從環(huán)境中提取高質量DNA，構建宏基因組文庫，從中篩選到功能基因或基因簇，展示宏基因組技術從環(huán)境中克隆任何生物體基因的可能性。通過構建宏基因組文庫，從中鑒定出的大多數基因都是新的基因。宏基因組技術可以應用于微生物基因資源的“生物探礦”。利用宏基因組文庫，已發(fā)現(xiàn)的新基因主要有：生物催化劑基因、抗生素抗性基因以及編碼轉運蛋白基因等。如纖維素酶基因、分解脂肪的基因、分解淀粉的基因、甲烷單加氧酶基因、紅曲霉功能基因等。

2.1.2 宏基因組技術篩選有價值的功能酶

近年來，宏基因組學技術對生物催化劑——新酶的篩選發(fā)現(xiàn)層出不窮。與大曲酒生產有關的酶類如淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、脂肪酶、酯酶等新功能酶（詳見表1），并可能獲得新酶的特征信息。特別是對于未培養(yǎng)微生物產生的酶類，通過宏基因組技術從環(huán)境中篩選分離得出，加以研究應用。大曲酒的固態(tài)發(fā)酵酒醅中含有多種微生物產生的多酶體系，一方面將原料中蛋白質、糖類、脂肪等大分子物質逐漸分解，供自身代謝作用；另一方面為乙醇和香味組分提供前體物質，或參與重要香味組分物質的形成。但是，目前對大曲酒發(fā)酵的功能酶和酶系的深入研究還是太少。因此，借助宏基因組技術分離純化大曲酒微生物分泌的功能酶，發(fā)現(xiàn)大曲酒生產用微生物的新的功能酶類，以利用這些酶類在大曲酒釀造過程發(fā)揮應有的作用[14]。

表1 已構建的宏基因組文庫及其篩選到的活性克隆

2.1.3 宏基因組技術選育微生物功能菌

生絲微菌是一類以甲醇作為唯一碳源和能源，通過出芽過程繁殖的柄細菌。該菌的生理特性使其難分離培養(yǎng)。吳衍庸等從酒窖環(huán)境中分離出生絲微菌(Hyphomacrobaum)的1 株純培養(yǎng)菌株，由于該菌具有生長消耗甲醇的生理特征，在老窖中的發(fā)現(xiàn)和分離，有可能對老窖發(fā)酵生產出的大曲酒所含的甲醇進行有效的調控。宏基因組技術不必經過純培養(yǎng)的分離方法，也可以尋找甲醇生物降解的功能菌。Radajewski 等利用13C 標記甲醇投加到橡樹林的土壤，富集一段時間，提取土壤總DNA，建立宏基因組文庫，篩選出13C 標記的DNA，經16S rRNA 擴增后，鑒定出一些微生物是可以利用甲醇做為碳源的微生物種群。

從大曲微生物、窖泥微生物以及生產現(xiàn)場環(huán)境微生物構成糟醅釀造微生物區(qū)系，通過發(fā)酵產品體現(xiàn)窖池主要功能菌的存在狀態(tài)。通過分離宏基因組文庫的基因，根據該基因尋找相應的微生物功能菌，可以達到認識功能菌效用和發(fā)揮其作用的目的。宏基因組學技術根據編碼基因尋找新微生物的培養(yǎng)條件，為微生物純培養(yǎng)技術提供可供選擇的培養(yǎng)基資源。如用4-羥基丁酸作唯一的碳源和能源篩選到了5 個能夠穩(wěn)定利用4-羥基丁酸的克隆子。經分析，這些克隆子具有4-羥基丁酸脫氫酶活性，據此可以利用該基因編碼的活性物質4-羥基丁酸作唯一的碳源，開展實驗室純培養(yǎng)。該方法主要是基于活性篩選技術的特殊條件——選擇性培養(yǎng)基，可以打破宏基因組技術對微生物功能菌的“可知不可求”的局面，它為實驗室培養(yǎng)編碼新基因的微生物提供了一條新途徑。所以，大曲酒的未培養(yǎng)微生物功能菌的獲得，可以借助根據宏基因組文庫提供的線索，通過新的培養(yǎng)方法，獲得具有重要生態(tài)功能的新的功能菌或未培養(yǎng)微生物的功能菌[14]。

2.2 宏基因組學技術應用于白酒微生物多樣性研究

2.2.1 宏基因組學技術應用于濃香型白酒微生物多樣性研究

（1）窖泥微生物的研究

中國濃香型白酒在工藝上與其他三大香型白酒最大的區(qū)別在于采用泥窖發(fā)酵，窖泥對于濃香型白酒“窖香濃郁，綿甜醇厚”風格的形成具有不可替代的作用。探索中國濃香型白酒窖池窖泥中微生物群落構成及其系統(tǒng)發(fā)育對濃香型白酒生產及品質監(jiān)控具有重要的指導意義。

董雅舒[15]應用PCR-DGGE 技術對濃香型白酒窖池細菌菌群進行了分析，測定了5 種樣品中的細菌菌群的組成，并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，得出濃香型窖池微生物具有明顯的多樣性。王福禎通過454焦磷酸測序法，對8 個濃香型窖泥樣本中原核和真核微生物進行了分析，發(fā)現(xiàn)原核微生物分屬于18個門，213 個屬，細菌總OTUs 有1183 個。同時還發(fā)現(xiàn)真核微生物群落分屬于5 個門，9 個綱，10 個目，13 個科，18 個屬，真菌總OTU 種類為64 個。王莉等[16]以細菌16S rDNA 的V6 區(qū)為對象，采用Illamina高通量測序平臺進行深度測序技術，對比分析了醬香型窖底泥與土壤微生物的差異。共獲得14156條高質量的V6 區(qū)標簽序，聚類分析共產生1801 條OTU 序列，其中土壤樣本680 條，使用1 個月的窖底泥樣本629 條，使用12 個月的窖底泥樣本492條。向文良等人利用PBS 緩沖液富集窖池酒醅中的微生物菌體，研究窖池中微生物區(qū)系分布及相互關系。在分子分類水平上，運用PCR 擴增技術和16S rDNA 序列同源性分析等方法測定窖池中原核微生物的16S rRNA 基因全序列，根據與基因數據庫中相似菌群16S rDNA 序列的同源性比較建立系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

Ding 等[17]通過nested PCR-DGGE 研究中國濃香型白酒的窖泥中的真菌和古菌群落多樣性，比較了取自窖池四壁（CW）和窖池底部（Cb）的窖泥真細菌和古細菌的微生物群落結構。此外，鄧杰、黃治國等[18-21]研究了窖池古菌群落結構及系統(tǒng)發(fā)育學分析，以及不同窖齡窖池窖泥中古菌群落結構；何翠容等[22]研究了濃香型白酒窖池細菌與古菌隨窖齡變化的特征；羅杰等[23]研究了濃香型白酒窖池窖泥中原核微生物菌群；于春濤[24-25]等分析了不同產區(qū)濃香型白酒窖泥中細菌多樣性和窖泥變質前后古菌群落差異；施思[26]研究了不同窖泥的微生物群落特征；湯斌[27]研究了窖泥中細菌多樣性的免培養(yǎng)技術；王濤等[28]研究了宜賓濃香型白酒窖泥中細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性；劉茂柯等[29]研究了窖泥古菌群落結構及其多樣性；陳衛(wèi)東從微觀角度論述了窖泥微生境的形成，闡述了環(huán)境因子、微生境分化及界面微生物細胞間的關系。唐玉明等對滬州老窖老窖池窖泥特性進行了系統(tǒng)分析，剖析了窖泥中各種理化成分的組成及新、老窖泥的特性差異。張麗鶯從環(huán)境因子、微生物區(qū)系及香氣成分三方面探討了窖池微生態(tài)在發(fā)酵過程中的變化情況，并據此建立了窖池微生態(tài)信息管理庫軟件。羅海、劉森等人對窖池不同空間位置窖泥所處的環(huán)境因子進行監(jiān)測，分析了窖池發(fā)酵過程中不同空間位置和不同發(fā)酵時間糟醅的環(huán)境因子伴隨微生物活動而發(fā)生的動態(tài)變化規(guī)律。

（2）酒曲微生物的研究

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒酒曲采用開放式生產，白酒微生物種類繁多，群系復雜，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法研究，會遺漏很多微生物種類，甚至可能是關鍵性功能微生物。隨著現(xiàn)代生物學技術的迅速發(fā)展，應用分子生物學技術對酒曲的研究也越來越多。

葉光斌應用PCR-DGGE 技術解析濃香型大曲發(fā)酵儲藏過程以及真菌群落的演替規(guī)律，結果表明，大曲真菌微生物復雜多樣，發(fā)酵環(huán)境以及真菌間的協(xié)調作用都對真菌的群落組成產生影響。王世寬對PCR-DGGE 用于濃香型大曲微生物群落分析的條件進行了優(yōu)化，結果表明，細菌DGGE 電泳最佳變性劑濃度梯度為35 %～55 %，真菌的最佳濃度為30%～50%，運用優(yōu)化后的條件進行測定，得出較豐富的微生物群落。李家民用DGGE 方法初步分析了濃香型大曲微生物真菌群落結構，結果表明，曲內微生物群落結構因大曲部位的不同而有所差異。PCR-SSCP(單鏈構象多態(tài)性)技術是通過DNA 構象差別來檢測點突變的方法。長度相同堿基序列不同的單鏈DNA 構象不同，形成了單鏈構象多態(tài)性，因而也適合分析微生物的多樣性，如羅惠波[30]用該法解析了濃香型大曲原核、真核微生物群落，結果表明，發(fā)酵各時期曲樣的群落結構相似，同時也具有多態(tài)性；不同微生物群落具有協(xié)同和制約的復雜生態(tài)學效應；各時期曲樣微生物多樣性指數均在1.69～2.01 之間，群落結構相對較穩(wěn)定；各曲樣微生物群落相似性位于0.67～1.00 之間，鄰近時期樣品間的相似性程度較高；主要優(yōu)勢真菌的菌群變化及生物學特征說明其代謝活動與濃香型白酒糟醅發(fā)酵中大分子物質的降解及白酒風味物質的形成密切相關。李家民等用DGGE 分析濃香型大曲時發(fā)現(xiàn)電泳圖中大曲真菌的條帶可多達21種，進一步對優(yōu)勢菌條帶鑒定為根霉(Rhizopussp.SAUFS3-1)、有孢圓酵母(Torulasporasp.SG5S08)和絲衣霉狀籃狀菌(Talaromyces yssochlamydoides)。葉光斌等用PCR-DGGE 條帶多樣品性及變化規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)濃香型大曲發(fā)酵、儲藏過程中真菌多樣性演替規(guī)律。劉孟華[31]以劍南春酒曲為研究對象，采用宏基因組學方法提取總基因組DNA，經PCR 擴增16S rDNA V4 區(qū)構建文庫并測序，進行劍南春酒曲中細菌群落多樣性的研究。結果表明，劍南春酒曲微生物群落構成較穩(wěn)定，主要分布在Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria 三大門中，占總量的95%以上。

（3）酒醅微生物的研究

Sun 等[32]通過Illumina Miseq 測序分析不同季節(jié)的中國濃香型白酒生產中的細菌多樣性，揭示了先前在糟醅中未鑒定的放線菌綱、普雷沃氏菌屬、產堿桿菌屬和葡萄糖醋桿菌。且結果證實，釀造季節(jié)對細菌群落結構的形成有關鍵影響。不同的釀造季節(jié)對發(fā)酵溫度和環(huán)境水分起到決定性作用，影響微生物的生長和死亡，改變細菌群落的數量，并在糟醅中形成獨特的細菌組成。向文良等利用16S RNA分析手段，對窖池糟醅中的微生物群落的區(qū)系分析及相互關系進行研究。張文學、喬宗偉等[33-36]對濃香型白酒窖池酒醅中細菌菌群、真菌菌群、微生物區(qū)系進行了動態(tài)分析。馮治平[37]采用PCRSSCP 技術研究了濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中古菌群落的變化規(guī)律，結果發(fā)現(xiàn)古菌群落在發(fā)酵過程中的變化較小。

2.2.2 宏基因組學技術應用于醬香型白酒微生物多樣性研究

譚映月等應用PCR-DGGE 技術分析醬香型白酒酒曲微生物多樣性，得出醬香型白酒微生物群落組成存在明顯差異。袁帥[38]以茅臺、國臺第4 次蒸餾前的酒糟為研究對象，對醬香型酒糟中細菌多樣性進行研究，構建16S rDNA V4 區(qū)文庫進行高通量測序分析，分別讀出6755 和6738 個OTUs,主要分屬11個門。

2.2.3 宏基因組學技術應用于清香型白酒微生物多樣性研究

蘭玉倩等應用PCR-DGGE 指紋技術分析了清香大曲酵母群落結構，得出在大曲生產過程中有7種主要的真菌。王海燕應用PCR-DGGE 技術對清香型汾酒微生物群落結構演替進行了研究。Zheng等[39]通過可培養(yǎng)和未培養(yǎng)方法研究了汾酒大曲中的微生物多樣性?；谄?6S rDNA（細菌）、26S rDNA 和ITS 區(qū)（真菌）的序列，分離并鑒定了總共190 個微生物菌株，包括109 個細菌和81 個酵母菌和霉菌。喬曉梅[40]等利用高通量測序法分析了冷季和熱季清香型白酒生產用曲真菌群落結構，結果共比對出90種真核生物。

2.2.4 宏基因組學技術應用于其他香型白酒微生物多樣性研究

李德林等用PCR-DGGE 技術對白酒酒醅微生物群落結構進行解析。結果表明，酒醅中微生物有18 個屬。高亦豹等利用PCR-DGGE 未培養(yǎng)技術，對中國白酒5 種高溫大曲和中溫大曲細菌群落結構分析，鑒定了大曲中細菌菌落信息。司波等對PCR-DGGE 技術在微生物群落研究方面的優(yōu)缺點進行了分析，并著重就其應用進行了闡述。孟鎮(zhèn)等用PCR-DGGE 電泳條帶分析中國白酒大曲中細菌多樣性，并沒有鑒定出微生物的具體組成。羅惠波等[30]和高亦豹等人利用PCR-DGGE 技術分析中高溫大曲細菌群落結構。喬宗偉等以常規(guī)的菌落分離培養(yǎng)及分類鑒定方法為主，以16S rDNA、18S rDNA序列分析為補充對全興酒廠酒醅微生物區(qū)系進行了分析。張晶[41]運用PCR-DGGE 技術研究了稻花香大曲微生物的群落結構和動態(tài)變化規(guī)律。衛(wèi)春會[42]研究了窖泥微生物群落SSCP 分析條件優(yōu)化。

2.3 宏基因組技術應用于白酒香味組分物質的研究

中國傳統(tǒng)大曲酒是世界上香味成分最為豐富的蒸餾酒。包括乙醇、高級醇、有機酸、酯、內酯、羰基化合物、芳香化合物、含氮化合物、含硫化合物等。據研究，茅臺酒有936 個色譜峰，濃香型酒有674 個色譜峰，清香型酒有486 個色譜峰。這些復雜的香味物質來自大曲酒的生產原料、特殊的釀造工藝及眾多微生物的發(fā)酵代謝產生。宏基因組技術為揭示大曲酒的酒香奧秘開辟出新天地。通過宏基因組篩選可以得到微生物代謝合成的有價值的化合物。新的化合物的篩選在一定條件下，先測定不同結構的物質在色譜中呈現(xiàn)不同的峰值，與宏基因組的基因片段轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖參照，來篩選產生新的化合物克隆子。如Courtois 等構建了土壤穿梭粘粒載體文庫，篩選出5000 個克隆，從中發(fā)現(xiàn)了11個新的聚酮合酶1(PKSI)的基因，采用HPLC 技術發(fā)現(xiàn)了脂肪二烯醇中2 種互為同分異構體的新化合物。Wang 等在篩選以鏈霉菌為宿主構建的宏基因組文庫中，從1020 個克隆子中發(fā)現(xiàn)2 個產生新結構化合物的克隆子，進一步純化分析獲得了A-E5種新的小分子抗菌化合物。

因此，運用宏基因組技術構建大曲酒微生物的宏基因文庫，通過特定篩選方法發(fā)現(xiàn)新的化合物來揭示大曲酒的香味物質的未知組分。崔利等對醬香型大曲酒含有眾多的香味物質吡嗪化合物提出一個推斷：在高溫制曲、高溫堆積環(huán)節(jié)、高溫發(fā)酵過程所產生的吡嗪化合物，除了酶和非酶參與的褐變反應外，應該說有相當部分是微生物代謝產物，因為這3 個階段中都有能夠產生吡嗪化合物的大量枯草桿菌。對此推斷，可以通過宏基因組技術通過試驗加以驗證。在高溫制曲、高溫堆積環(huán)節(jié)、高溫發(fā)酵3 階段，宏基因組技術提取環(huán)境微生物DNA，構建宏基因組文庫，通過測定吡嗪化合物的色譜峰，參照宏基因組的基因片段轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，來篩選能夠產生吡嗪化合物的克隆子，通過基因測序分析和16S rRNA 擴增鑒定，有可能找出產生吡嗪化合物的 那一 種 微生 物[3]。Wang 等[43]進行 基 于PCR 的 變性梯度凝膠電泳（DGGE）和16S rRNA 基因文庫分析，分析兩種不同原料發(fā)酵的中國酒的細菌群落結構。結果表明，強香味發(fā)酵谷物中的主要細菌是來自類芽孢桿菌，擬桿菌屬和梭菌的主要細菌，而焙烤芝麻香味發(fā)酵谷物中的主要細菌屬于芽孢桿菌，黃桿菌和丙酮桿菌。液體發(fā)酵的細菌多樣性的分子分析將有益于在液體香料成分的形成中起關鍵作用的重要微生物的分析。Li 等[44]使用克隆庫和焦磷酸測序法研究了清香型酒汾酒的細菌和真菌群落多樣性。通常，只有幾種類型的細菌和真菌是有助于白酒發(fā)酵過程的主要微生物。我們的研究結果表明，更多不同的細菌和真菌物種聯(lián)合的作用貢獻了汾酒在不同時期的發(fā)酵過程。這項研究提供的證據表明，添加一種或多種細菌和真菌物種可以改善傳統(tǒng)或工業(yè)酵母菌株發(fā)酵中酒的質量。此外，在不同時間段有助于發(fā)酵過程的細菌和真菌物種的知識可能有助于控制酒的生產系統(tǒng)和提高酒的質量。另一方面，潛在地篡改汾酒質量的細菌和真菌物種應該受到更多的關注和進一步的研究。關于對化學和物理性質與主要微生物之間的相關性，以及有助于發(fā)酵過程細菌和真菌的假設類型，進行更詳細檢驗的進一步研究是必要的。

3 結束語

宏基因組學在白酒行業(yè)中的研究主要集中在微生物多樣性研究方面，其中關于濃香型白酒的研究很多，醬香型、清香型和其他香型白酒的研究相對少一點。此外，宏基因組學在白酒微生物資源發(fā)掘和白酒香味組分的研究方面，也起了很大的推動作用。對白酒釀造微生物的研究，多年來一直是行業(yè)熱點，但對微生物群落作為整體的性能認識是不足或片面的，特別是微生物菌群和多酶體系的認識缺乏，影響我們對白酒微生物菌落代謝機理的系統(tǒng)全面的認識。另外，缺乏系統(tǒng)性的研究。比如醬香型白酒1 輪次到7 輪次的微生物區(qū)系，發(fā)酵過程中微生物組成變化、功能微生物組成及變化、功能性成分分析、風味組分研究、微生物菌落代謝機理等等，缺乏系統(tǒng)性的研究。不同香型，不同地區(qū)白酒之間的這些研究也缺乏系統(tǒng)的橫向比較。人類基因組測序完成已有許多年。但是，基因組信息如何指導基因在特定空間和時間表達的機理仍有待闡明。這些問題并不能只依賴宏基因組學解決，基于此，我們可以采用宏基因組學、宏蛋白組學，宏代謝組學，宏轉錄組學、風味組學等方法，并結合全基因組的三維空間結構和功能研究，更加系統(tǒng)深入的研究認識白酒釀造過程和組成成分。