劉源，杜冰，張雪，金美玉，鄭志紅

（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部，沈陽 110122）

卵泡連續(xù)多階段的發(fā)育過程受多因素調(diào)節(jié)。在原始卵泡形成到原始卵泡活化階段，卵泡發(fā)育不依賴促性腺激素，而依賴于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的信息傳遞［1-3］，多種轉(zhuǎn)錄因子和旁分泌因子在這一階段發(fā)揮重要作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族成員，是卵泡內(nèi)重要的旁分泌因子，在卵泡發(fā)育不依賴促性腺激素階段，對卵泡增殖分化、類固醇激素合成和卵丘擴(kuò)張等發(fā)揮重要作用，敲除Bmp15后小鼠排卵率降低［4-5］。但卵泡內(nèi)調(diào)控Bmp15的因素目前尚未明確。研究［6］表明，叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3（forkhead box O3，F(xiàn)oxo3）轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，BMP15蛋白表達(dá)水平明顯下降。此外，本課題組通過對雌性精子發(fā)生和卵子發(fā)生的特定基本螺旋-環(huán)-螺旋1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helixloop-helix 1，Sohlh1）（-/-）型小鼠卵巢的基因表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)Bmp15基因表達(dá)水平也顯著下調(diào)，因此推測FOXO3、SOHLH1可能調(diào)控Bmp15。本研究擬探討FOXO3和轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1是否通過調(diào)控旁分泌因子BMP15影響卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞交流，旨在完善轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1影響卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間信號交流的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用SPF級C57BL/6J雌鼠均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，環(huán)境溫度保持在20～26 ℃之間，相對濕度40%～70%，光控交替時間12/12 h。本研究經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會及實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會審查通過。

主要試劑：2×Phanta Max Master 酶（中國諾唯贊Vazyme公司），AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國愛思進(jìn)AXYGEN公司），T4連接酶、BamHⅠ、KpnⅠ-HF、HindⅢ-HF限制性內(nèi)切酶（美國NEW ENGLAND Biolabs公司），DH-5α感受態(tài)細(xì)胞（日本TaKaRa公司），lipofectamine 3000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光二抗（美國Invitrogen公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京普洛麥格Promega公司），EZChIP Chromatin Immunoprecipitation Kit（德國默克MERCK公司），F(xiàn)OXO3、SOHLH1抗體（英國Abcam公司），小鼠IgG抗體（美國賽默飛公司）。

1.2 Bmp15-pGL3.0重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 獲取Bmp15基因啟動子區(qū)目的片段：應(yīng)用Primer 5軟件對Bmp15啟動子-2 000 bp～+200 bp區(qū)域序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上、下游引物分別添加KpnⅠ-HF（GGGTACCC）和HindⅢ-HF（GGATCC）的酶切位點(diǎn)。引物序列如下，Bmp15-F，5’-CGGGGTACCTAAA CGAGCATGGTAAGGGCG-3’，位于-1 279 bp～-1 264 bp；Bmp15-R，5’-CCCAAGCTTACAGGCTAA AGTAACCGAGGAG-3’，位于-447 bp～-431 bp。提取C57BL/6J小鼠卵巢組織基因組DNA作為模板，擴(kuò)增Bmp15啟動子區(qū)。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，包括DNA 2.0 μL，Bmp15-F（10 μmol/L）2.0 μL，Bmp15-R（10 μmol/L）2.0 μL，2×Phanta Max Master 25.0 μL，DDW19.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72 ℃退火5 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒連接及鑒定：將1.2.1得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，隨后使用KpnⅠ-HF、HindⅢ-HF限制性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物及pGL3.0-Basic載體酶切。將酶切后的Bmp15啟動子區(qū)目的片段和pGL3.0-Basic載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，平皿培養(yǎng)并測序鑒定。

1.3 Foxo3-pcDNA3.0質(zhì)粒構(gòu)建

應(yīng)用Primer 5軟件對Foxo3CDS區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上、下游引物分別添加HindⅢ（GGATCC）和BamHⅠ（AAGCTT）的酶切位點(diǎn)。引物序列：Foxo3-F，5’-CCCAAGCTTAAGATGGCAGAGGCAC CAGC-3’；Foxo3-R，5’-CGGGATCCAGGGTCTGCTT TGCCCATTTC-3’。由于本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建質(zhì)粒需插入的Foxo3CDS區(qū)片段較長，為保障提取RNA的完整性，采用中國博科BioBase公司UPure Tissue RNA Kit進(jìn)行RNA提取，后續(xù)步驟同1.2。

1.4 Foxo3-pcDNA3.0和Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì)粒表達(dá)分析

采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Foxo3-pcDNA3.0和Sohlh1-pcDNA3.0（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部前期構(gòu)建）在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)水平。將蓋玻片放入6孔板中，每孔加入3 mL完全培養(yǎng)基。接種HEK293T細(xì)胞（2.5×105/孔）。12 h后，按照lipofectamine 3000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明分別轉(zhuǎn)染100 μg純化后的Foxo3-pcDNA3.0和Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì)粒，培養(yǎng)24 h、48h后，取出6孔板內(nèi)蓋玻片。冷丙酮固定生長在蓋玻片上的HEK293T細(xì)胞8 min，5%BSA室溫封閉2 h，加入用5%BSA稀釋400倍的FOXO3、SOHLH1一抗，4 ℃過夜。TBST清洗，加入熒光二抗，室溫1 h，TBST清洗，DAPI染色，封片。熒光顯微鏡下觀察FOXO3、SOHLH1蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測FOXO3、SOHLH1

對Bmp15啟動子活性的影響

37 ℃、5% CO2條件下，在24孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至約50%～70%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞設(shè)為6組，每組4個復(fù)孔，每孔接種1.5×105個HEK293T細(xì)胞。第一組轉(zhuǎn)染pGL3.0-Basic載體100 ng，第二組轉(zhuǎn)染Bmp15-pGL3.0質(zhì)粒100 ng，第三組轉(zhuǎn)染Bmp15-pGL3.0和Sohlh1-pcDNA3.0各100 ng，第四組轉(zhuǎn)染Bmp15-pGL3.0、Sohlh1-pcDNA3.0和Foxo3-pcDNA3.0質(zhì)粒各100 ng，第五組轉(zhuǎn)染Bmp15-pGL3.0和Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì) 粒 各100 ng，F(xiàn)oxo3-pcDNA3.0質(zhì)粒200 ng，第六組轉(zhuǎn)染Bmp15-pGL3.0和Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì)粒各100 ng，F(xiàn)oxo3-pcDNA3.0質(zhì)粒300 ng。各組均加入TK質(zhì)粒80 ng。轉(zhuǎn)染后48 h，棄除培養(yǎng)液，1×PBS清洗細(xì)胞。按照Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，分別檢測螢火蟲熒光值和海腎熒光值。啟動子活性用相對活性值（螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值）表示。

1.6 染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）實(shí)驗(yàn)

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找小鼠Bmp15基因組DNA序列，確定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000 bp序列，在Bmp15基因啟動子中查找SOHLH1的結(jié)合位點(diǎn)（CANNTG）和FOXO3的結(jié)合位點(diǎn)（TGTAAACA），根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)位置設(shè)計(jì)ChIP-PCR引物（表1）。

表1 ChIP-PCR引物Tab.1 Sequences of ChIP primers

超聲粉碎C57BL/6小鼠卵巢，使細(xì)胞中的DNA破碎成200～2 000 bp小片段。按照EZ-ChIP試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將SOHLH1、FOXO3特異性抗體免疫沉淀產(chǎn)物作為ChIP實(shí)驗(yàn)組，將小鼠IgG抗體免疫沉淀產(chǎn)物作為ChIP實(shí)驗(yàn)陰性對照，PCR后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所得DNA產(chǎn)物中是否含有FOXO3和轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1的結(jié)合位點(diǎn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測各重復(fù)3次，應(yīng)用 GraphPad Prism 5軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.000 5為差異有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxo3-pcDNA3.0表達(dá)質(zhì)粒、Bmp15-pGLBasic重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒酶切鑒定后送測序，酶切電泳結(jié)果（圖1）與BLAST結(jié)果提示2種質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Plasmid construction results

將Sohlh1-pcDNA3.0質(zhì)粒和Foxo3-pcDNA3.0過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，24、48 h后分別觀察SOHLH1、FOXO3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOHLH1和FOXO3均可在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，且在細(xì)胞核、質(zhì)中均有分布（圖2）。HEK193T細(xì)胞中含有內(nèi)源性FOXO3蛋白，但含量極低，與過表達(dá)質(zhì)粒相比，免疫熒光觀察不到（圖2）。

2.3 FOXO3抑制了SOHLH1對Bmp15的轉(zhuǎn)錄激活作用

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖3）顯示，SOHLH1可以上調(diào)Bmp15基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，F(xiàn)OXO3抑制了轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對Bmp15啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活作用，且FOXO3表達(dá)水平越高，抑制作用越強(qiáng)。HEK293T細(xì)胞系含有內(nèi)源性FOXO3，但通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性FOXO3表達(dá)微弱。

2.4 ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)FOXO3、SOHLH1與小鼠卵巢中Bmp15基因啟動子區(qū)結(jié)合

ChIP結(jié)果顯示，SOHLH1蛋白能與Bmp15啟動子（-170 bp，80 bp），（-450 bp，-220 bp），（-745 bp，-560 bp），（-1 410 bp，-1 200 bp）區(qū)間結(jié)合。FOXO3能與Bmp15啟動子（120 bp，183 bp），（-84 bp，-75 bp），（-442 bp，-395 bp），（-546 bp，-470 bp），（-674 bp，-665 bp）區(qū)間結(jié)合（圖4E～4I）。

2.5 FOXO3蛋白和轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1在Bmp15啟動子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的分析

SOHLH1和FOXO3在Bmp15啟動子上有多個結(jié)合位點(diǎn)，并且Bmp15啟動子上相鄰的SOHLH1和FOXO3結(jié)合位點(diǎn)距離很近且有部分重合，相距最大距離約100 bp，在Bmp15啟動子（-400 bp，-405 bp）和（-544 bp，-546 bp）區(qū)域，SOHLH1和FOXO3的結(jié)合位點(diǎn)重合（圖5）。

3 討論

圖2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果Fig.2 Cell immunofluorescence results

卵泡發(fā)育依賴于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的信息傳遞［7］，卵母細(xì)胞內(nèi)受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，KIT）/磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）信號通路在原始卵泡活化階段發(fā)揮重要作用，顆粒細(xì)胞分泌受體酪氨酸激酶配體（KIT ligand，KITL）與卵母細(xì)胞表面KIT結(jié)合后激活卵母細(xì)胞內(nèi)下游信號因子 PI3K，PI3K 活化后使得二磷酸肌酶磷酸化為三磷酸肌酶，進(jìn)而激活A(yù)kt，活化后的Akt磷酸化FOXO3，磷酸化的FOXO3出核后，原始卵泡活化［8-9］。當(dāng)原始卵泡活化發(fā)育為初級卵泡后，卵母細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD信號通路開始調(diào)控卵泡的發(fā)育。BMP15屬于TGF-β家族，在初級卵泡階段的卵母細(xì)胞中表達(dá)，BMP15和GDF9以旁分泌的形式從卵母細(xì)胞分泌至卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的間隙，與顆粒細(xì)胞上的BMP受體結(jié)合，磷酸化并激活顆粒細(xì)胞內(nèi)的SMADs蛋白，SMAD1、SMAD5、SMAD8 蛋白作為通路中的信號因子，活化后磷酸化效應(yīng)因子SMAD4，后者進(jìn)入顆粒細(xì)胞核，調(diào)控SMAD靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增長與分化［10-13］。

圖3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果Fig.3 Results of double luciferase reporter experiments

SOHLH1是生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于原始卵泡到初級卵泡階段，對原始卵泡的活化有重要作用［14-15］。當(dāng)Sohlh1敲除后，卵母細(xì)胞中KIT/PI3K/Akt信號通路中信號因子發(fā)生顯著變化，原始卵泡無法活化［16］。本研究證實(shí)SOHLH1和FOXO3均可與Bmp15啟動子區(qū)結(jié)合，SOHLH1可以上調(diào)Bmp15基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，且FOXO3可抑制SOHLH1對Bmp15啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活作用，且該抑制作用隨FOXO3表達(dá)量增加而逐漸增強(qiáng)。因此，推測FOXO3可能通過競爭性結(jié)合Bmp15的轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)影響SOHLH1對Bmp15的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖4 ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 ChIP results

圖5 FOXO3和轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1在Bmp15啟動子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.5 Analysis of the binding sites of FOXO3 and the transcription factor SOHLH1 in the promoter regions of genes Bmp15

由于SOHLH1與FOXO3都能與Bmp15啟動子結(jié)合，因此推測在卵泡組裝過程中，F(xiàn)OXO3入核并結(jié)合在Bmp15啟動子上，占據(jù)了SOHLH1的結(jié)合位點(diǎn)，并抑制其轉(zhuǎn)錄，使Bmp15在原始卵泡階段不能表達(dá)，當(dāng)原始卵泡活化為初級卵泡后，F(xiàn)OXO3磷酸化從卵母細(xì)胞核中移出，釋放了Bmp15啟動子上SOHLH1的結(jié)合位點(diǎn)，使SOHLH1能夠轉(zhuǎn)錄激活Bmp15，Bmp15在初級卵泡的卵母細(xì)胞中得以表達(dá)，隨后BMP15從卵母細(xì)胞旁分泌至顆粒細(xì)胞表面，繼續(xù)參與SMAD通路，完成卵母細(xì)胞對顆粒細(xì)胞的調(diào)控；也有另外的可能就是SOHLH1與FOXO3同時結(jié)合在Bmp15啟動子上，F(xiàn)OXO3影響了SOHLH1對Bmp15的轉(zhuǎn)錄，或者FOXO3直接與SOHLH1結(jié)合并影響了SOHLH1對Bmp15的轉(zhuǎn)錄，具體通過何種途徑造成FOXO3阻礙了SOHLH1對Bmp15的轉(zhuǎn)錄激活，其深入機(jī)制還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。