時姍姍，沈 勤，葉勝兵，吳 楠，王 璇，夏秋媛，李 銳，鮑 煒，周曉軍

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)缺陷型胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是近年發(fā)現(xiàn)的一類SDHB免疫陰性，具有特征性臨床病理表現(xiàn)的異質(zhì)性腫瘤，其臨床病理學特征、免疫表型及分子遺傳學改變均不同于Kit或PDGFRa突變型GIST[1]。目前對其臨床病理學特征有了一定的認識，但這類腫瘤的分子發(fā)病機制尚未明確。本實驗從366例原發(fā)性GIST中篩選出26例SDH缺陷型，首次用甲基化特異性PCR、直接測序法觀察SDH基因突變以及啟動子甲基化狀態(tài)，并結(jié)合患者的臨床病理資料，深入探討SDH缺陷型GIST的臨床病理學特征、免疫表型、分子遺傳學改變以及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2005～2010年解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病理科存檔的366例GIST，由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2012)消化系統(tǒng)腫瘤分類標準，并通過檢測Kit及PDGFRa基因及SDHB免疫陰性篩選出26例SDHB缺陷型GIST，收集患者的臨床病理資料。

1.2 方法

1.2.1免疫組化及結(jié)果判斷 免疫組化染色采用EnVision法。一抗包括CD117(Polyclonal, Dako公司，稀釋度1∶100)、DOG1(Polyclonal，福州邁新公司，稀釋度1∶100)、SMA(1A4，ZETA公司，稀釋度1∶300)、S-100(Polyclonal，Dako公司，稀釋度1∶2 000)、Ki-67(MIB1，福州邁新公司，稀釋度1∶300)和SDHB(21A11AE7，Abcam公司，稀釋度1∶300)。高倍鏡(400×)下選取10個有代表性的視野，計算免疫標記細胞的陽性率(陽性瘤細胞數(shù)/總瘤細胞數(shù))×100%。細胞陽性率占0～5%為陰性(-)；6%～10%為灶狀陽性(+)；11%～50%為中度陽性()；51%～100%為彌漫強陽性()。

1.2.2直接測序法 根據(jù)基因庫DNA序列設計引物(表1)，分別擴增SDHB基因8個外顯子、SDHC基因6個外顯子及SDHD基因4個外顯子，包含全部編碼序列。所有引物均由上海桑尼生物公司合成。用DNA測序儀3730進行DNA雙向測定序列，結(jié)果經(jīng)ABI公司軟件分析。

1.2.3DNA CpG島甲基化檢測 采用“MethPrimer”在線軟件預測SDHA、SDHB基因啟動子區(qū)CpG島甲基化檢測引物(表1)，并用全基因組擴增(WGA)的DNA驗證甲基化引物的特異性。以至少為100 bp，GC含量>50%，CpG出現(xiàn)頻率>0.6為篩選標準。根據(jù)操作流程使用DNA亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化試劑盒(QIAGEN)。經(jīng)處理后，DNA上非甲基化的胞嘧啶“C”轉(zhuǎn)化為尿嘧啶“U”，而發(fā)生甲基化的“C”處理后不變。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定結(jié)果：未發(fā)生甲基化的DNA序列，測序C的位置被T取代；發(fā)生甲基化的CpG島，測序出現(xiàn)“C”單峰或“C”和“T”的套峰。

表1 SDHx基因引物

2 結(jié)果

2.1 臨床特征根據(jù)免疫表型SDHB陰性，Kit與PDGFRa基因檢測為野生型的診斷標準，從366例原發(fā)性GIST中篩選出26例SDH缺陷型GIST，占全部病例的7.10%。26例中：男性13例，年齡35～67歲，平均51.38歲；女性13例，年齡18～71歲，平均50.00歲。高風險5例(19.23%)，中風險5例(19.23%)，低風險5例(19.23%)，極低風險11例(42.31%)。發(fā)病部位：胃23例(88.46%)，小腸2例(7.70%)，其他1例(3.85%)。1例(3.85%)腫瘤直徑≥10 cm，25例(96.15%)<10 cm。21例(80.77%)核分裂象<5個/50 HPF，1例核分裂象介于5～10個/50 HPF(3.85%)，4例(15.38%)核分裂象≥10個/50 HPF(表2)。

2.2 病理特征及免疫表型根據(jù)組織學特點SDH缺陷型GIST分為3種亞型：梭形細胞型21例、上皮樣細胞型4例及混合型1例(圖1)。除SDHB陰性外，26例GIST沒有顯示出特異的免疫表型：CD117及DOG1均呈強陽性，SMA及S-100陰性或散在弱陽性，Ki-67增殖指數(shù)常常較低。

AB

2.3 基因檢測結(jié)果基因突變及啟動子甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果顯示(表2，圖2)，15例(57.69%)至少存在一項SDH基因異常，其中6例存在兩項SDH基因異常。10例(38.46%)檢測出基因氨基酸編碼區(qū)域突變，3例發(fā)生雙突變。共13個突變位點，SDHB基因突變3例(11.54%)，SDHC基因突變3例(11.54%)，SDHD基因突變7例(23.08%)。突變類型包括10例錯義突變，3例同義突變。10例(38.46%)檢測出基因啟動子甲基化異常，其中SDHA基因甲基化8例(30.77%)，SDHB基因甲基化3例(11.54%)，1例SDHA、SDHB基因同時甲基化。

表2 26例SDH缺陷型胃腸道間質(zhì)瘤的臨床病理資料

圖2 SDHx測序圖及甲基化測序圖：A.(例2)SDHD基因E1 1A>G錯義突變(M1V)；B.(例3)SDHD基因E1 39C>T同義突變(A13A)；C.(例5)SDHB基因啟動子甲基化；D.(例6)SDHA基因啟動子甲基化

3 討論

GIST是消化系統(tǒng)最常見的間葉性腫瘤，近年來發(fā)現(xiàn)了一類SDHB免疫陰性的亞型，被稱為SDH缺陷型GIST[2]，易出現(xiàn)在Carney三聯(lián)征、Carney-Stratakis綜合征中[3-5]。SDH缺陷型GIST具有獨特的臨床病理特征：多見于女性，易發(fā)生于胃，具有上皮樣細胞形態(tài)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，也可為多灶性，Kit及PDGFRa基因野生型[1,6]。但這些特征并非絕對特異性[7]，為進一步闡明SDH缺陷機制，采用甲基化特異性PCR、直接測序法檢測26例SDH缺陷型GIST中SDH亞基基因突變狀態(tài)及啟動子甲基化水平，探討該類型GIST潛在的分子機制。

本組366例原發(fā)性GIST，利用免疫表型及基因檢測結(jié)果篩選SDH缺陷型26例，占全部病例的7.10%，與報道中SDH缺陷型GIST占成人散發(fā)性GIST的5%～7.5%基本相符[8]?；颊咝詣e無明顯差異，但發(fā)病年齡年輕化[9]。26例中23例發(fā)生于胃，與Doyle等[3]報道的結(jié)果基本相符，但Carney-Strataki綜合征或Carney三聯(lián)征SDH缺陷型GIST發(fā)病部位僅限于胃[10]。組織學上，上皮樣細胞形態(tài)比例較高[9]。除SDHB免疫陰性外，26例GIST沒有顯示出特異的免疫表型[11-12]，Ki-67增殖指數(shù)常常較低，提示腫瘤預后較好。這些臨床病理特征均提示這類腫瘤具有獨特的發(fā)病機制及治療方式[1,6]。

SDH位于線粒體內(nèi)膜，屬于線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ的復合酶，具有4個亞基(A～D)，均屬于抑癌因子[13]。SDH在三羧酸循環(huán)中通過電子傳遞，催化琥珀酸氧化到延胡索酸[13]，目前已證實這個反應在代謝中起著至關重要的作用，如電子傳遞、底物水平磷酸化、酮體利用、血紅素代謝等。對其研究一直以來主要局限于線粒體呼吸介質(zhì)和能源生產(chǎn)者，但近年開始關注其它方面的作用[14]，如導致某些代謝性病的并發(fā)癥，促進炎癥的活化反應[15]、腫瘤的發(fā)生及進展等[16]。SDH復合物中任何一個亞蛋白的缺陷，特別是SDHB將破壞復合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，影響其功能[6]，從而造成琥珀酸的異常積累。作為線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的鐵硫亞基，SDHB通常在胞質(zhì)中呈顆粒狀表達。SDHB免疫陰性是SDHB突變的嗜鉻細胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤的診斷標志物[11,17]，也是衡量復合物功能失活的重要指標[11,18]。

對于SDH缺陷型GIST的亞基突變的研究，Janeway等[19]發(fā)現(xiàn)4例SDHB和SDHC突變，而Miettinen等[8]則未檢測到SDHx基因突變。在家族性SDH缺陷型GIST中約50%發(fā)生SDH亞基突變，其中A亞基占30%，因此推測存在其他形式造成功能缺陷可能性[20-21]。除基因突變，SDHB蛋白缺失可能還由于亞基的等位基因丟失、表觀遺傳修飾、基因啟動子區(qū)的甲基化，或參與SDH復合物穩(wěn)定性的其他蛋白缺陷導致功能的喪失[22-23]。目前有關SDH缺陷型GIST中啟動子甲基化的研究較少，2015年報道1例存在SDHC基因異常甲基化[24]。本實驗檢測到10例(38.46%)亞基基因發(fā)生氨基酸編碼區(qū)域突變，13個突變位點。其中10個錯義突變，直接影響其氨基酸序列。甲基化特異性PCR法檢測到10例(38.46%)基因啟動子甲基化異常。26例樣本中，15例(57.69%)至少存在一項SDH基因異常，提示基因啟動子的甲基化，基因突變都是腫瘤抑制因子失活的重要機制。啟動子甲基化可造成基因沉默，從而導致腫瘤形成及發(fā)展。6例樣本中存在至少兩項SDH基因異常，提示存在基因多種異常共同作用的可能性。

本實驗存在一定局限性，由于SDHA基因結(jié)構(gòu)非常復雜，內(nèi)含子區(qū)域與編碼區(qū)高度同源，因此只檢測SDHB、SDHC、SDHD基因狀態(tài)。其次FFPE樣本的前期處理損傷，會對甲基化檢測造成巨大的挑戰(zhàn)，導致部分檢測失敗。這些有待在今后的工作中改進。

通過研究表明SDHB表達缺失可能由于多種機制引起，包括亞基基因突變、亞基基因啟動子甲基化，或多種異常共同作用，提示SDH基因突變及啟動子甲基化參與了腫瘤的形成。本實驗有助于進一步研究SDH缺陷型GIST的發(fā)病機制，并為這部分患者潛在的治療靶點提供了一定的理論依據(jù)。