劉春玲 鄭海興 孫艷

【摘要】目的 分析阿爾茨海默?。ˋD）患者血清外泌體的提取鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)狀況。方法 選擇30例AD患者作為研究對象，取空腹靜脈血制備血清標(biāo)本。以Exo Quick試劑盒提取外泌體，并以鈾鉛雙染色法處理后的組織塊置于電鏡下鑒定;選用TBST、PVDF開展蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果 30例AD患者血清外泌體的直徑為（92.64±23.41）nm;且所有標(biāo)本的CD63檢測均呈陽性。AD患者伴免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原表達(dá)異常。結(jié)論 AD患者的血清中含有外泌體，其免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原表達(dá)異常可為AD診斷、病情進(jìn)展評估提供支持。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病;外泌體;蛋白質(zhì)組學(xué)

作為老年群體的常見病，AD以預(yù)后差、病程長為基本特征[1]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，這一狀況限制了其治療體系的擴(kuò)展。研究指出，外泌體與AD的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[2]。因此，分析AD患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及研究對象

儀器：微量移液器;低溫高速離心機(jī);酶標(biāo)儀;電泳槽等。試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒;兔抗CD63;ECL底物液;Exo Quick Exosome Precipitation Solution（以下記為Exo Quick試劑盒）等。

選擇我院于2018年10月～2019年7月收治的30例AD患者為研究對象。男19例，女11例;年齡（64.7±11.6）歲。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集方法

于清晨采集30例AD患者的空腹靜脈血5 ml，置于血清分離膠試管內(nèi)。于室溫條件下持續(xù)靜置0.5 h后，置于4℃溫度下，按照3000 r/min轉(zhuǎn)速，持續(xù)離心5 min，取上層血清標(biāo)本保存待檢。

1.2.2 外泌體提取鑒定方法

提取方法：將血清標(biāo)本置入干凈試管內(nèi)，向其中混入適量Exo Quick，充分混勻后，于4℃條件持續(xù)孵育0.5 h;所得混合物按照1500 r/min轉(zhuǎn)速持續(xù)離心0.5 h;清除上清液后，再次按照上述轉(zhuǎn)速離心處理5 min，即可獲得外泌體（沉淀）。向沉淀內(nèi)混入100～500 μl 1x PBS重懸液，獲取外泌體溶液。

鑒定方法：于4℃條件下，以0.1 M磷酸緩沖液及2.5%濃度戊二醛固定2 h外泌體（形態(tài)：組織塊）;采用大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)固定后的外泌體組織塊，持續(xù)漂洗3次;于室溫下，經(jīng)0.1 M磷酸緩沖液、1%鋨酸持續(xù)固定2 h;取大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)第二次固定處理的外泌體，漂洗次數(shù)與第一次漂洗一致;將外泌體組織塊分別置于濃度為50%、70%、80%、90%、95%及100%的酒精上進(jìn)行脫水處理;以812包埋劑、純812包埋劑進(jìn)行滲透處理;于60℃條件下，持續(xù)聚合48 h;按照60～80 nm標(biāo)準(zhǔn)，針對外泌體組織塊進(jìn)行切片;以鈾鉛雙染色法進(jìn)行染色處理，最后將其置于電鏡下進(jìn)行鑒定。

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

經(jīng)封閉處理后，以封閉液稀釋一抗，于一抗孵育液內(nèi)浸入PVDF膜，置于4℃條件下持續(xù)孵育（過夜）;采用TBST洗去多余一抗;以封閉液稀釋二抗（HRP標(biāo)記），確認(rèn)PVDF膜充分浸潤于二抗孵育液內(nèi)后，于37℃條件下孵育2 h;以TBST洗去多余二抗;按照1：1比例，混合過氧化物酶及增強(qiáng)液，于PVDF膜表面滴加適量工作液，待充分反應(yīng)后，以X光膠片進(jìn)行壓片處理，分別以顯影液、定影液顯影、定影，最終獲得膠片。將掃描出的膠片采用BandScan進(jìn)行分析（灰度值參數(shù)）。以電泳儀完成蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。

2 結(jié) 果

本研究中AD患者的外泌體鑒定結(jié)果為：平均直徑（92.64±23.41）nm;30份標(biāo)本的CD63抗體檢測結(jié)果均呈陽性。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果提示：外泌體組塊中，免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原表達(dá)異常。

3 討 論

近年來，AD發(fā)病率逐漸升高[3]。明確AD的發(fā)病機(jī)制、早期診斷AD，已經(jīng)成為改善AD患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。

外泌體作為一種常見小膜泡，其可由多類細(xì)胞分泌。這種膜泡天然存在于乳汁、尿液等體液中。這種膜泡被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞的侵襲機(jī)制、免疫應(yīng)答及細(xì)胞遷移等多種機(jī)制中[4]。近年來，隨著臨床關(guān)于這種膜泡研究的不斷深入，其與AD之間的關(guān)聯(lián)逐漸引起了人們的重視。外泌體可參與海馬神經(jīng)元突觸、神經(jīng)發(fā)育及再生機(jī)制。當(dāng)機(jī)體星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元分泌外泌體后，處于游離狀態(tài)的外泌體可與受體細(xì)胞發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)體包膜發(fā)生融合反應(yīng)，對疾病相關(guān)蛋白形成一定的調(diào)控作用?；谏鲜鲎饔?，可初步判斷：外泌體與AD的形成及發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。

對于患者血清中的外泌體，可用的檢測方法較多，如色譜法及超速離心法等。上述方法雖然可證實(shí)血清標(biāo)本中外泌體的存在，但所提取的外泌體標(biāo)本，難以保持良好的生物活性及純度水平。相比之下，Exo Quick試劑盒所采用的免疫沉淀法，則可借助沉淀反應(yīng)，將存在于患者血清中的外泌體以沉淀形式提取出來，且這種方法可保障提取物具有生物活性。本研究以Exo Quick試劑盒提取并經(jīng)電鏡鑒定，30例AD患者的外泌體直徑參數(shù)與既往研究一致。這一結(jié)果表明：這種提取方法，可為AD患者的診斷及病情評估提供一定支持。

而從AD患者外泌體組塊的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果來看，其在多種蛋白質(zhì)方面存在異常表達(dá)現(xiàn)象。根據(jù)上述結(jié)果，可考慮將免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原這三種蛋白納入AD的初篩診斷、預(yù)后評估中，通過對患者上述三種蛋白表達(dá)狀況的監(jiān)測，判斷其合并AD的風(fēng)險(xiǎn)，并以此為依據(jù)，調(diào)整AD患者的治療方案。

綜上所述，Exo Quick試劑盒可為AD血清外泌體的提取鑒定提供支持，而蛋白質(zhì)組學(xué)分析則有助于更新AD的診斷方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 張 銳，王永祥，杜怡峰.外泌體在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制和診療中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（18）：3547-3551.

[2] 王周凡.阿爾茨海默病患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].南華大學(xué)，2018.

[3] 陳建交，趙 斌，趙 杰，等.外泌體microRNAs在阿爾茨海默病中的潛在診斷價(jià)值[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2017，48（06）：401-408.

[4] 張麗玲.血漿神經(jīng)來源的外泌體表達(dá)蛋白作為阿爾茨海默病早期診斷生物標(biāo)志物的研究[D].天津醫(yī)科大學(xué)，2017.