黃應(yīng)翔

（福建省老年醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 福州350009）

曲霉菌廣泛存在于自然界中，為條件致病菌，可在肺或上呼吸道大量繁殖生長并全身播散致病。 肺曲霉?。≒ulmonary Aspergillosis, PA）是一種臨床常見的肺部真菌感染性疾病，臨床分為3型：肺曲霉球、變態(tài)反應(yīng)性曲霉病、侵襲性肺曲霉?。↖nvasive Pulmonary Aspergillosis, IPA）[1]。其中，IPA 嚴(yán)重威脅著免疫受損患者的生命，IPA 早期癥狀隱匿，痰培養(yǎng)陽性率低（＜10%）。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nucleotide Binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3, NLRP3）受體是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體， 參與多種疾病炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[2]。 文獻(xiàn)報(bào)道在應(yīng)激、炎癥、免疫反應(yīng)狀態(tài)下，NLRP3可表達(dá)于多種炎性細(xì)胞內(nèi)，NLRP3激活后可定位到質(zhì)膜啟動(dòng)下游因子受體相互作用蛋白（RIP2）、核因子-κB（NF-κB）活化，促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)，該信號(hào)通路貫穿于整個(gè)炎癥過程[3]。 由于對(duì)NLRP3在曲霉菌感染中發(fā)揮作用的研究尚少，NLRP3、RIP2及NF-κB 三者在肺曲霉病發(fā)病機(jī)制中扮演的角色尚不明確。 本研究旨在探討NLRP3、RIP2、NF-κB 在肺曲菌病患者外周血中的表達(dá)情況，探討其相關(guān)致炎機(jī)制。 現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月～2019年10月福建省老年醫(yī)院收治的肺曲菌病患者62例為研究對(duì)象，分為侵襲性肺曲霉菌病組（IPA 組）24例和非侵襲性肺曲霉菌病組（NIPA 組）38例，并選取同期20例非真菌感染者作為對(duì)照組。 其中男45例，女37例；年齡54～81歲，平均（57.68±15.35）歲。 所有患者采血前簽署知情同意書，本次研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2008年美國感染病學(xué)會(huì)曲霉病診治臨床實(shí)踐指南的分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)，將肺曲霉病分為確診、擬診和疑診3級(jí)[4]。 確診患者需要組織病理學(xué)依據(jù)或者符合正常無菌部位標(biāo)本曲霉培養(yǎng)陽性標(biāo)準(zhǔn)，擬診需同時(shí)滿足宿主因素、臨床表現(xiàn)和微生物學(xué)證據(jù)條件，疑診需滿足宿主因素外，還需有臨床表現(xiàn)或微生物學(xué)證據(jù)中一項(xiàng)。 非侵襲性肺曲霉病組包括慢性肺曲霉病、過敏性肺曲霉病、慢性壞死性肺曲霉病。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本處理 入院后留取各組患者外周血5ml，2500r/min 離心10min， 將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管保存。 再用PBS 洗滌血小板2次，以800r/min 離心10min 獲得沉淀， 加入1ml-1Trizol 重懸。 按Trizol 一步法提取總RNA，加20μl 無RNA 酶的水溶解，按照Takara 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書要求合成cDNA，標(biāo)本存于-80℃。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測NLRP3、RIP2和NF-κB mRNA 水平 每組取1ml 的外周血標(biāo)本，加入200ul 的Trizol 裂解液中， 先提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 依據(jù)GenBank 設(shè)計(jì)NLRP3、RIP2、NF-κB、β-actin 引物序列。 見表1。 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min 30s；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)40次；最后72℃延伸5min。每份標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔， 復(fù)孔間Ct 值差異＜0.5， 以β-actin為內(nèi)參，Ct 值減去內(nèi)參的Ct 值作為△Ct， 用2-△△Ct 表示目的基因的表達(dá)量。

表1 依據(jù)GenBank 序列設(shè)計(jì)引物

1.3.3 Western Blot 法檢測NLRP3、RIP2、NF-κB 蛋白表達(dá) 每條泳道上樣后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗、二抗孵育，ECL 發(fā)光試劑顯色后攝像，圖像分析，測定灰度值，以NLRP3、RIP2、NF-κB 與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-actin 蛋白灰度值對(duì)比作為相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 ELISA 檢測外周血超敏C 反應(yīng)蛋白 （hs-CRP）與白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)水平 嚴(yán)格根據(jù)人hs-CRP 和IL-6的ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 觀察指標(biāo)比較三組NLRP3、RIP2、NF-κB mRNA 及蛋白表達(dá)水平，三組外周血hs-CRP 與IL-6表達(dá)水平， 采用Spearman 相關(guān)性分析分析NLRP3mRNA 與RIP2、NF-κB、IL-6、hs-CRP 之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Spearman 相關(guān)性分析。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組NLRP3、RIP2和NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較 所有標(biāo)本重復(fù)3次，并計(jì)算各組均值，將3組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 IPA組、NIPA 組NLRP3、RIP2、NF-κB mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且IPA 組高于NIPA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 三組NLRP3、RIP2、NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組NLRP3、RIP2、NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NIPA 組比較，#P＜0.05。

組別 n NLRP3mRNA RIP2mRNA NF-κB mRNA對(duì)照組NIPA 組IPA 組FP 2024381.34±0.353.45±0.85*7.57±1.71*#22.3610.0091.59±0.337.93±1.93*12.09±3.21*#18.4820.01812.43±3.3136.63±9.11*59.73±13.03*#19.4530.011

2.2 三組NLRP3、RIP2和NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較 將三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IPA 組、NIPA 組NLRP3、RIP2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且IPA 組高于NIPA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 三組NLRP3、RIP2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 三組NLRP3、RIP2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NIPA 組比較，#P＜0.05。

組別 n NLRP3 RIP2 NF-κB對(duì)照組NIPA 組IPA 組FP 2024380.76±0.091.21±0.22*1.84±0.63*#32.2810.0040.59±0.121.23±0.57*1.78±0.47*#28.6370.0100.48±0.110.98±0.22*1.42±0.53*#23.6910.023

2.3 三組IL-6、hs-CRP 水平比較 將三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IPA 組、NIPA組炎癥介質(zhì)IL-6、hs-CRP 水平均高于對(duì)照組，且IPA 組高于NIPA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 三組IL-6與hs-CRP 水平比較（±s）

表4 三組IL-6與hs-CRP 水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NIPA 組比較，#P＜0.05。

組別 n IL-6（ng/ml） hs-CRP（mg/L）對(duì)照組NIPA 組IPA 組F P 2024386.32±1.3719.47±4.85*25.53±6.02*#19.5220.0173.98±0.8912.46±3.42*19.27±4.25*#22.7520.008

2.4 NLRP3mRNA 與RIP2、NF-κB、IL-6、hs-CRP的相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)性分析顯示，NLRP3mRNA 水平與下游基因RIP2、NF-κB mRNA 水平呈正相關(guān)（相關(guān)指數(shù)r=0.676，P＜0.001；r=0.513，P＜0.001）；炎癥介質(zhì)IL-6、hs-CRP 水平與NLRP3mRNA水平呈正相關(guān)（相關(guān)指數(shù)r=0.467，P＜0.001；r= 0.621，P＜0.001）。 隨著炎癥介質(zhì)水平的升高，NLRP3mRNA 表達(dá)水平亦上升。

3 討論

曲霉菌是一類條件致病性真菌，對(duì)機(jī)體致病的曲霉包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉等，肺是曲霉菌最常累及的部位[5]。 肺曲霉病可分布在不同臨床科室，臨床特點(diǎn)缺乏特異性，實(shí)驗(yàn)室檢查陽性率低，故極易被漏診。 曲霉菌侵入呼吸道，隨即吸入的分生孢子可以激活肺泡中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生固有免疫，存活下來的曲霉菌株可觸發(fā)炎性細(xì)胞的吞噬作用。 肺泡中炎性細(xì)胞在介導(dǎo)肺炎癥反應(yīng)中具有重要作用，激活多種信號(hào)通路，釋放炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[6]。 本研究通過觀察NLRP3-RIP2-NF-κB 信號(hào)途徑在肺曲霉病患者外周血中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討肺曲霉菌的發(fā)病機(jī)制，以期為臨床靶向治療提供依據(jù)。

NLRP3激活后可定位到細(xì)胞質(zhì)膜，RIP2激酶作為其下游激活物， 進(jìn)一步啟動(dòng)NF-κB 因子活化，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)一系列炎癥介質(zhì)分泌[3]。關(guān)于炎性小體NLRP3在肺曲霉病患者中的表達(dá)情況的研究尚少， 故本研究通過觀察肺曲霉病患者外周血中NLRP3、RIP2、NF-κB 的表達(dá)情況，進(jìn)一步討論炎性小體在肺曲霉病患者發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用。 我們發(fā)現(xiàn)IPA 組和NIPA 組NLRP3、RIP2、NF-κB mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組高，NLRP3mRNA 水 平 與 下 游 基 因RIP2、NF-κB mRNA 水平呈正相關(guān)（P＜0.001）。 說明炎性小體NLRP3參與肺曲霉患者的發(fā)病過程，發(fā)病機(jī)制可能是通過激活下游信號(hào)RIP2， 進(jìn)一步活化NF-κB，誘導(dǎo)下游炎癥介質(zhì)、黏附分子及相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白等轉(zhuǎn)錄、表達(dá)[7]。 在肺曲霉菌侵襲的狀態(tài)下，經(jīng)過上述一系列級(jí)聯(lián)式反應(yīng)活化肺泡巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞自噬，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，惡性循環(huán)使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大化，最終加重肺損傷，這與國外Gresnigt MS 等[8]人報(bào)道結(jié)果相一致。 可見本研究結(jié)果提示NLRP3為肺曲霉菌發(fā)病過程的重要始動(dòng)因子，且參與了發(fā)病過程的調(diào)控，將其作為防治肺曲霉病的重要靶點(diǎn)具有一定的臨床價(jià)值。

IL-6、hs-CRP 作為下游重要的炎癥介質(zhì)， 啟動(dòng)調(diào)節(jié)急性應(yīng)激反應(yīng)，加重炎癥損傷，其水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。IL-6是一類趨化炎癥介質(zhì)，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生， 具有多種生物學(xué)特點(diǎn)，能夠刺激參與細(xì)胞增殖、分化并提高其功能，促進(jìn)炎癥損傷，加重肺部感染。 hs-CRP 作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在肺部真菌感染的早期CRP 與細(xì)胞膜形成復(fù)合物沉積于血管內(nèi)皮細(xì)胞， 促進(jìn)炎性滲出[9]。 我們研究發(fā)現(xiàn)肺曲霉病患者炎癥介質(zhì)IL-6與hs-CRP 水平與正常對(duì)照組比較明顯升高，尤其IPA組患者升高明顯（P＜0.001）；相關(guān)性分析提示炎癥介質(zhì)IL-6、hs-CRP 水平與NLRP3mRNA 水平呈正相關(guān)（P＜0.001）。 說明炎癥介質(zhì)IL-6、hs-CRP 升高與肺曲霉菌感染嚴(yán)重程度具有一定關(guān)系， 可以將NLRP3受體定量水平及下游炎癥介質(zhì)作為評(píng)估肺部曲霉菌感染嚴(yán)重程度的輔助效應(yīng)指標(biāo)。

綜上所述， 外周血中NLRP3基因表達(dá)水平升高在肺曲霉病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。其機(jī)制可能與NLRP3-RIP2-NF-κB 信號(hào)途徑有關(guān)，激活下游炎癥介質(zhì)hs-CRP、IL-6等釋放， 可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重。 可考慮將NLRP3受體水平及下游炎癥介質(zhì)作為診斷曲霉菌感染嚴(yán)重程度的輔助指標(biāo)，但關(guān)于肺曲霉病的具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。