,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.中南林業(yè)科技大學(xué),稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410004)

花青素(Anthocyanin)是廣泛存在于水果、谷物和蔬菜中的一類水溶性天然色素,結(jié)構(gòu)主要是由C6-C3-C6為基本的C骨架組成的,屬于酚類化合物中的類黃酮類[1]?；ㄇ嗨鼐哂休^高的抗氧化活性,是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的抗氧化劑之一。此外,花青素還具有抑制腫瘤、降低血脂、增強(qiáng)視力及消炎等多種藥理功能[1-2]。研究表明,花青素在食品中有著廣泛的應(yīng)用,一是直接開發(fā)為健康產(chǎn)品,二是作為食品添加劑使用[3]。例如,以紫薯和大米為主要原料壓榨釀出的紫薯酒,其體外抗氧化活性高于葡萄酒[4];Sui[5]研發(fā)出一種功能性面包——“花青素營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化面包”,為糖尿病患者提供了更健康的選擇。

花青素大量存在于黑米中,作為一種由禾本科植物稻經(jīng)長(zhǎng)期培育形成的一類具有特殊香味的香米品種[6],黑米的營(yíng)養(yǎng)素含量?jī)?yōu)于普通大米[7]。研究表明,黑米比普通白米難消化和吸收[8-9],這將有利于減緩人體餐后血糖升高,治療肥胖和糖尿病等慢性疾病[10]。然而,目前黑米比普通白米消化慢的原因尚未研究清楚。推測(cè)其可能有三方面因素,一是黑米中富含的花青素或膳食纖維通過(guò)抑制淀粉酶的活性,從而降低淀粉的消化速率;二是淀粉與花青素發(fā)生相互作用,形成耐酶解的結(jié)構(gòu)或者影響了淀粉的理化性質(zhì),進(jìn)而影響淀粉消化[11];三是增加抗性淀粉含量,作者前期研究已證明(未發(fā)表)。對(duì)于多酚影響淀粉的理化性質(zhì),前人早有研究報(bào)道。例如,Xiao等[12]研究發(fā)現(xiàn)黑茶多酚能顯著降低淀粉的初始溫度、峰值溫度、終值溫度以及糊化焓值。Karunaratne等[13]研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以降低玉米淀粉的糊化溫度和糊化焓。Chai等[14]研究發(fā)現(xiàn),茶多酚能與玉米淀粉中的直鏈淀粉發(fā)生相互作用,進(jìn)而改變了淀粉的理化特性。然而,目前花青素與淀粉之間的相互作用及其機(jī)制尚未見研究報(bào)道。

因此,有必要研究花青素對(duì)淀粉理化性質(zhì)的影響,進(jìn)而解釋黑米比白米消化慢的原因,旨在填補(bǔ)這方面研究的空白并為開發(fā)新型花青素類淀粉食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低直鏈大米淀粉(LAR)(直鏈淀粉含量為3.15%，淀粉含量為90.006%)，提自珍珠糯米 陽(yáng)新縣祥云糧油食品有限公司；中直鏈大米淀粉(IAR)(直鏈淀粉含量為8.39%，淀粉含量為90.092%，提自賽亞?wèn)|北香米)、高直鏈大米淀粉(HAR)(直鏈淀粉含量為19.39%，淀粉含量為90.431%，提自賽亞桃花米) 襄樊賽亞米業(yè)有限公司，上述三種淀粉均依據(jù)文獻(xiàn)[15]提??；黑米花青素 本實(shí)驗(yàn)室自制，純度79.66%；其他試劑 均為分析純。

204-F1差示掃描量熱儀 德國(guó)Netzsch公司;AR2000ex流變儀 美國(guó)TA Instryment有限公司;Nexus470傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司;Quanta200掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;X’Pert PRO X射線衍射儀 荷蘭帕鈉科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉與碘結(jié)合能力的測(cè)定 參考柴艷偉[16]的方法稍作改動(dòng),準(zhǔn)確稱取50 mg三種淀粉,分別添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉質(zhì)量),加入去離子水,配制成2%淀粉乳溶液。沸水浴加熱30 min,冷卻至室溫,取0.1 mL混合液加入0.1 mL碘溶液(0.8% KI,0.08% I2),用水定容至5 mL,混合均勻,避光反應(yīng)15 min。之后于500～900 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,空白為相應(yīng)濃度花青素與碘試劑混合的樣品。

1.2.2 淀粉熱力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 參考李蟠瑩等[17]的方法:分別添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉質(zhì)量)于三種淀粉中,采用標(biāo)準(zhǔn)銦對(duì)差示掃描量熱儀(DSC)進(jìn)行溫度和熱焓的校正。稱取混合物3 mg加入PE坩堝中,加入一定量的去離子水,保證混合物的水分含量為70%左右,密封,4 ℃下平衡 24 h。之后用DSC測(cè)定體系的熱力學(xué)性質(zhì),測(cè)試條件為:以10 ℃/min的速度從25 ℃加熱到100 ℃。以空坩堝作為空白對(duì)照。

1.2.3 淀粉流變性質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.1 靜態(tài)流變 分別添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉質(zhì)量)于三種淀粉中,然后向混合物中加入去離子水配成淀粉質(zhì)量為5%的淀粉漿,混勻后置于沸水浴糊化30 min,冷卻至室溫后立即測(cè)定。利用流變儀測(cè)定淀粉的表觀黏度隨剪切速率的變化。測(cè)定條件為:靜態(tài)測(cè)量模式,測(cè)試溫度為25 ℃,20 mm平板,間隙0.5 mm,剪切速率為0.1～100 s-1。

1.2.3.2 動(dòng)態(tài)流變 按照1.2.3.1的方法,制備8%的淀粉糊樣品,冷卻至室溫后立即測(cè)定其彈性模量(G′)和黏性模量(G″)隨震蕩頻率的變化。測(cè)定條件為:20 mm 平板,間隙0.5 mm,測(cè)試溫度為25 ℃,震蕩頻率0.1～10 Hz,應(yīng)力為2%。

1.2.4 傅里葉紅外光譜(FT-IR)的測(cè)定 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷卻后4 ℃貯存7 d,冷凍干燥后粉碎過(guò)100目篩,采用FT-IR對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,1 mg的樣品與120 mg的KBr混合,充分研磨均勻后,放入模具中壓片。測(cè)試條件為:掃描次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1,測(cè)量范圍為4000～500 cm-1。

1.2.5 淀粉結(jié)晶性質(zhì)的測(cè)定 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷卻后4 ℃貯存7 d,冷凍干燥后粉碎過(guò)100目篩,采用全自動(dòng)X-射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,特征射線Cu靶,管壓40 kV,電流40 mA。掃描范圍為5～45 °(2θ),掃描速度為4 °/min。參照Miao等[18]的方法計(jì)算下列參數(shù)。

Rc(%)=Ac/(Ac+Aa)(100

式中:Rc為相對(duì)結(jié)晶度,Ac為結(jié)晶區(qū)面積,Aa為非結(jié)晶區(qū)面積。

1.2.6 淀粉顆粒形貌觀察 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷卻后4 ℃貯存7 d,冷凍干燥后粉碎過(guò)100目篩,將樣品用雙面膠固定在掃描電鏡樣品臺(tái)上,真空噴金,然后用掃描電鏡(SEM)觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.6和Excel 2010作圖,對(duì)采集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素對(duì)淀粉與碘結(jié)合能力的影響

由圖1可知,加入花青素后,曲線的吸光度下降,表明花青素可以與淀粉結(jié)合,從而抑制直鏈淀粉-碘、支鏈淀粉-碘復(fù)合物的形成。淀粉與碘的吸光值曲線的峰值均向短波長(zhǎng)方向偏移,且在HAR-花青素體系中,吸光度峰值的偏移程度最大。這可能是由于花青素與直鏈淀粉結(jié)合,使得直鏈淀粉與碘的結(jié)合能力下降,吸收峰值發(fā)生藍(lán)移。吸光值下降的程度越顯著,說(shuō)明花青素對(duì)淀粉與碘結(jié)合物的形成影響越顯著[19]。對(duì)于LAR而言,隨花青素含量的增加,曲線的吸光度降低,但降幅較小;對(duì)于IAR而言,添加少量的花青素時(shí),吸光度降幅較低,但是在高添加量時(shí),吸光度的降幅較大,對(duì)HAR而言,在花青素添加量較少時(shí),吸光度便明顯降低,這也說(shuō)明花青素與直鏈淀粉結(jié)合的比例更高。對(duì)三種淀粉而言,當(dāng)添加10%的花青素時(shí),曲線的吸光值峰值相較于原淀粉分別下降14.56%、25.11%和33.83%。說(shuō)明花青素對(duì)淀粉與碘的結(jié)合與直鏈淀粉含量相關(guān)。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象,例如Yang等[20]人研究發(fā)現(xiàn)毛竹葉多酚能和淀粉發(fā)生相互作用,并使淀粉-碘復(fù)合物的吸光度降低。

圖1 花青素對(duì)LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)與碘結(jié)合能力的影響Fig.1 Effects of anthocyanins on the binding ability of LAR(a),IAR(b)and HAR(c)to iodine

2.2 淀粉對(duì)花青素?zé)崽匦缘挠绊?/h3>

通過(guò)DSC可以測(cè)定淀粉糊化溫度和糊化焓,熱焓值反映了糊化淀粉在貯存過(guò)程中相鄰的雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合形成的結(jié)晶體的熔化。從表1可知,添加10%花青素的三種體系相對(duì)于原淀粉糊化溫度分別下降了6.99%、7.64%、9.35%;峰值溫度分別下降了3.52%、6.13%和7.44%;糊化焓值分別下降了23.92%、44.91%和59.89%,且終止溫度隨花青素添加量增加均呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榛ㄇ嗨氐挠H水性羥基在某種程度上與直鏈淀粉非結(jié)晶區(qū)發(fā)生了結(jié)合,改變了淀粉結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的耦合力,從而減小了破壞淀粉分子結(jié)構(gòu)時(shí)所需要的能量[21]。這與Wu等[22]報(bào)道的茶多酚對(duì)淀粉糊化焓值的影響結(jié)果一致。且添加不同比例的花青素后,體系的糊化溫度、糊化焓的下降趨勢(shì)與直鏈淀粉含量相關(guān)。

表1 淀粉-花青素體系的糊化溫度及焓值Table 1 Gelatinization temperatures and enthalpy of starch-anthocyanin

2.3 花青素對(duì)淀粉流變特性的影響

2.3.1 靜態(tài)流變特性 從圖2可知,隨著剪切速率的升高,三種淀粉的表觀黏度均降低,具有剪切變稀的性質(zhì),為假塑性流體。在淀粉糊中,線性大分子鏈(主要為直鏈淀粉)相互纏繞,阻礙了分子的相互運(yùn)動(dòng)。當(dāng)給予剪切作用時(shí),分子鏈取向就會(huì)被拉直,纏結(jié)點(diǎn)逐漸減少,流動(dòng)阻力降低,從而使表觀黏度下降[23]。此外,從圖2可知,添加不同比例的花青素后,體系的黏度相對(duì)于原淀粉呈下降趨勢(shì),這可能是由于花青素與直鏈淀粉產(chǎn)生了氫鍵相互作用,使淀粉與花青素之間的纏繞作用加強(qiáng),淀粉體系中分子鏈節(jié)的順向性增強(qiáng),流動(dòng)阻力降低,表觀黏度下降[24]。并且體系的黏度相對(duì)于原淀粉減小的程度和直鏈淀粉含量相關(guān)。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)降低淀粉黏度的現(xiàn)象,例如Chai等[14]研究發(fā)現(xiàn),茶多酚能夠顯著降低高直鏈玉米淀粉的黏度。

圖2 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)體系的表觀黏度隨剪切速率的變化Fig.2 Change apparent viscosity with shear rate of anthocyanins-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems

2.3.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性 儲(chǔ)能模量(G′)反映的是物體的固體性質(zhì);損耗模量(G″)反映的是物體的液體性質(zhì);tanδ是G″與G′的比值,表示物體彈性和黏性的相對(duì)大小。從圖3可以看出,隨著掃描頻率的增加,三種淀粉及淀粉-花青素體系的G′與G″均逐漸增大。所有樣品均表現(xiàn)為一種典型的弱凝膠動(dòng)態(tài)流變學(xué)性質(zhì)。淀粉-花青素體系的tanδ值均大于原淀粉,說(shuō)明花青素的加入使得體系的彈性降低。對(duì)三種淀粉-花青素體系而言,隨著花青素含量的增加,淀粉-花青素體系的G′與G″下降越顯著。這是因?yàn)榛ㄇ嗨氐募尤?減少了淀粉糊體系內(nèi)部直鏈淀粉分子鏈段間的纏結(jié)點(diǎn),從而破壞了凝膠體系的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[25]。且花青素對(duì)淀粉體系粘彈性的影響與直鏈淀粉含量相關(guān)。Zhang等[26]的研究表明蘆丁和槲皮素可能與小麥淀粉中的直鏈淀粉通過(guò)疏水作用結(jié)合到螺旋內(nèi)腔中,導(dǎo)致淀粉鏈之間交聯(lián)纏繞的機(jī)會(huì)減少,因此凝膠網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)度降低。

圖3 花青素-LAR(a,b)、IAR(c,d)、HAR(e,f)體系的動(dòng)態(tài)黏彈性Fig.3 Dynamic viscoelastic properties of anthocyanin-LAR(a,b),IAR(c,d)and HAR(e,f)systems

2.4 花青素對(duì)淀粉紅外圖譜的影響

從圖4中可知,三種淀粉均在3400 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)極強(qiáng)的-OH鍵的伸縮峰。然而,在加入花青素之后,-OH吸收峰向低波長(zhǎng)方向發(fā)生了輕微的紅移,說(shuō)明分子間的氫鍵作用增強(qiáng)。這主要是由于淀粉鏈上羥基的O電負(fù)性大,與多酚羥基上的H發(fā)生靜電吸引作用,使-OH的電子更偏向O,-OH共價(jià)鍵被拉伸,進(jìn)一步使H周圍的電子云密度降低,導(dǎo)致羥基峰發(fā)生紅移[27]。在2930 cm-1的峰是C-H伸縮振動(dòng)峰,與淀粉中的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)相關(guān)[28]。1400 cm-1的峰是C-OH伸縮振動(dòng)峰[29]。添加花青素后淀粉的紅外圖譜與原淀粉的峰形相似,說(shuō)明花青素的加入沒有破壞淀粉的基本結(jié)構(gòu),且花青素與淀粉主要通過(guò)非共價(jià)鍵(氫鍵或者疏水相互作用)結(jié)合。據(jù)報(bào)道,多酚與淀粉之間主要通過(guò)氫鍵發(fā)生相互作用,且氫鍵的形成抑制了淀粉自身螺旋的形成,降低了其有序性[30]。

圖4 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)體系的紅外圖譜Fig.4 FT-IR spectra of anthocyanin-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems注：a→e表示花青素的添加量為:0%、1%、2%、5%、10%。

2.5 花青素對(duì)淀粉結(jié)晶性質(zhì)的影響

淀粉顆粒是由結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)交替構(gòu)成的多晶體體系,且能呈現(xiàn)一定的X射線衍射圖譜,結(jié)晶區(qū)呈現(xiàn)尖峰特征,非結(jié)晶區(qū)呈現(xiàn)出彌散特征[31]。原淀粉在2θ為17°出現(xiàn)了較強(qiáng)的衍射峰,為B型特征峰[32]。在2θ為20°時(shí)出現(xiàn)的吸收峰為淀粉內(nèi)的油脂酸類與直鏈淀粉在回生過(guò)程中形成的復(fù)合物[33]。由圖5及表2可知,隨著花青素添加比例的增加,復(fù)合物在2θ角為17°衍射峰峰強(qiáng)降低,添加10%花青素的LAR、IAR、HAR體系結(jié)晶度相對(duì)于原淀粉分別下降了7.99%、15.49%和24.87%。這說(shuō)明花青素能夠有效抑制淀粉的回生,且抑制回生的效果與直鏈淀粉含量相關(guān)。Liu等[30]研究表明原花青素可以有效抑制淀粉回生,一方面可能是由于原花青素與直鏈淀粉分子通過(guò)氫鍵結(jié)合,阻礙了淀粉分子間雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成,從而達(dá)到抑制淀粉回生的作用。另一方面可能是原花青素與水分子同時(shí)進(jìn)入到淀粉顆粒中,在回生過(guò)程中與支鏈淀粉的短鏈結(jié)合,抑制其短鏈分子間的雙螺旋作用。

圖5 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)體系的XRD圖譜Fig.5 XRD pattern of anthocyanin-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems注：a→e表示花青素的添加量為:0%、1%、2%、5%、10%。

表2 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)體系的相對(duì)結(jié)晶度Table 2 Relative crystallinity of anthocyanin-LAR(a),

2.6 花青素對(duì)淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

從圖6可知,糊化后4 ℃儲(chǔ)存7 d的大米淀粉經(jīng)過(guò)冷凍干燥后,結(jié)構(gòu)緊密,有輕微的凸起。在加入花青素后,體系的結(jié)構(gòu)變得疏松多孔,且隨著花青素添加量的增加,結(jié)構(gòu)越來(lái)越疏松,孔洞也明顯增多。孔洞的形成是由于在冷凍干燥的過(guò)程中,淀粉脫水而形成。而孔洞的疏松程度取決于淀粉的回生程度,回生程度越小,孔洞越疏松。這表明花青素的加入抑制了淀粉的回生,可能的原因是花青素通過(guò)非共價(jià)鍵作用與淀粉發(fā)生了相互作用,阻礙淀粉分子之間相互聚集[20];也可能是加入花青素后水分的蒸發(fā)減慢,體系含水量比原淀粉高,增加了淀粉分子的自由度,阻礙了淀粉分子之間的聚集,從而抑制淀粉的回生。其他學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)多酚可以使得淀粉的微觀結(jié)構(gòu)變得疏松,例如Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)毛竹葉多酚可以使淀粉凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得更加疏松,而對(duì)于這一現(xiàn)象的確切解釋仍然有待進(jìn)一步的研究。

圖6 花青素-LAR(A～E)、IAR(A1～E1)、HAR(A2～E2)體系的表面結(jié)構(gòu)Fig.6 Surface structures of anthocyanin-LAR(A～E),IAR(A1～E1),and HAR(A2～E2)systems注:A、A1、A2:0%花青素;B、B1、B2:1%花青素;C、C1、C2:2%花青素;D、D1、D2:5%花青素;E、E1、E2:10%花青素。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以不同比例的花青素與直鏈淀粉含量不同的淀粉復(fù)合,考察了花青素對(duì)不同直鏈淀粉含量的淀粉理化特性的影響。結(jié)果表明,花青素能與直鏈和支鏈淀粉發(fā)生結(jié)合。隨著花青素添加比例的增加,淀粉的糊化溫度、糊化焓、結(jié)晶度、表觀黏度和黏彈性相對(duì)于原淀粉均發(fā)生明顯下降。淀粉的紅外光譜圖表明花青素與淀粉發(fā)生了非共價(jià)鍵作用,這種作用可能是氫鍵或疏水相互作用。通過(guò)掃描電鏡,觀察淀粉的微觀形貌發(fā)現(xiàn),隨著花青素添加量的增加,淀粉結(jié)構(gòu)變得疏松多孔,說(shuō)明樣品的回生程度減小。本實(shí)驗(yàn)證明花青素的添加能夠有效改變淀粉的理化特性,這為進(jìn)一步研究黑米比白米消化慢的原因提供了理論依據(jù)。