吳文英,尹術(shù)華,李 露,宋也好,李文娟

(南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330000)

魚腥草(heartleaf houttuynia herb)屬三白草科蕺菜的干燥地上部分,是一種藥食同源的傳統(tǒng)食材[1],在食品、藥品等方面有很大的開發(fā)前景。魚腥草化學(xué)成分較為繁多,主要由生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等多種成分組成。在這些活性成分中,魚腥草揮發(fā)油(heartleaf houttuynia herb essential oil,HHO)被認(rèn)為是其主要活性成分,主要包括甲基正壬酮、乙酸龍腦酯、棕櫚酸、正癸酸等;具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增加免疫力等多種生物活性功能[2]。目前,房蕓等[3]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草揮發(fā)油對糖尿病小鼠心肌損傷有一定的保護(hù)作用;臨床上,含魚腥草揮發(fā)油的注射液用于治療病毒性心肌炎,可減輕病毒對心肌細(xì)胞損害,調(diào)節(jié)免疫功能,提高心臟功能,針對病毒性心肌炎及心源性休克患者[4-5]。此外,已有研究發(fā)現(xiàn)魚腥草揮發(fā)油對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用[6],證實(shí)魚腥草揮發(fā)油可能對心臟具有較好的保護(hù)作用。邁入21世紀(jì),疾病模式已發(fā)生轉(zhuǎn)變,腫瘤已經(jīng)成為危害全球健康的重要?dú)⑹諿7]。多柔比星(doxorubicin,DOX)是一種廣譜高效抗腫瘤藥物,臨床療效顯著,但其嚴(yán)重的心臟毒性使得其應(yīng)用受到了很大的限制[8]。食源性組分魚腥草揮發(fā)油前期研究顯示具有心肌保護(hù)作用,然而對DOX所致的心肌損傷的影響仍需進(jìn)一步研究。

因此,本實(shí)驗(yàn)提取了魚腥草揮發(fā)油,通過氣相色譜質(zhì)譜法(GS-MS)自帶NIST庫并結(jié)合保留指數(shù)鑒定其化學(xué)成分,應(yīng)用SD大鼠建立DOX心肌損傷模型,研究魚腥草揮發(fā)油對抗腫瘤藥物DOX所致的心肌損傷的影響及相關(guān)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

魚腥草干葉 市售;DOX 深圳萬樂藥業(yè)有限公司;乙醇 分析純,西隴化工股份有限公司;維生素E(VE)、DPPH、BHT 美國Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天公司;LDH試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司;SD大鼠 (180±20) g 60只,雄性,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,使用許可證:SCXK(湘)2016-0002。

安捷倫7890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;3K15-冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司;SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;AL-104電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Thermo 3001 Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;SKM型數(shù)顯恒溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚腥草揮發(fā)油的提取 參照2010年版中國藥典一部附錄X D揮發(fā)油測定法(甲法)提取揮發(fā)油[9]，并結(jié)合文獻(xiàn)[10]確定水蒸氣蒸餾法提取魚腥草揮發(fā)油的最佳工藝條件:魚腥草經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗粉,室溫下浸泡蒸餾水中10 h,料液比為1∶10,加熱回流10 h。將干燥魚腥草粉碎后,稱取100 g燥魚腥草粉末,裝入2000 mL圓底燒瓶中,加蒸餾水1000 mL,混勻并浸泡10 h后,連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。將整套裝置放置于SKM型數(shù)顯恒溫電熱套中,溫度設(shè)置220 ℃,達(dá)到微沸狀態(tài),并保持微沸10 h,加熱回流10 h后停止加熱,收集揮發(fā)油。

1.2.2 魚腥草揮發(fā)油的成分分析 采用GC-MS進(jìn)行魚腥草揮發(fā)油的成分分析[11]。精密量取1.2.1中提取得到的魚腥草揮發(fā)油7.5 μL,加1.5 mL正己烷,并用無水硫酸鈉除水,4 ℃、5000 r/min離心10 min,得到體積分?jǐn)?shù)0.5%的魚腥草揮發(fā)油待測液,通過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后直接進(jìn)樣分析。正構(gòu)烷烴(C7-C30)用正己烷稀釋過膜后直接進(jìn)樣。

GC條件:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(0.25 μm×250 μm×30 m),載氣為高純氦氣,柱流量1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流進(jìn)樣,分流比20∶1,進(jìn)樣口溫度280 ℃,升溫程序:0～2 min,初溫70 ℃保持2 min;2～5 min,10 ℃/min 升至100 ℃;5～16.5 min,2 ℃/min升至123 ℃;16.5～19.5 min,123 ℃保持3 min,19.5～26.9,5 ℃/min升至160 ℃;26.9～32.9 min,10 ℃/min升至220 ℃;32.9～37.9 min,2 ℃/min升至230 ℃;37.0～42.9 min,230 ℃保持5 min。

MS條件:接口溫度280 ℃,電離方式為EI電離,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,MS四級桿溫度150 ℃,溶劑延遲3 min,掃描質(zhì)量范圍:質(zhì)荷比20～500 amu。

魚腥草揮發(fā)油成分保留指數(shù)的測定:保留指數(shù)計(jì)算公式為[12-13]:

式中:RI為待測組分的保留指數(shù);TRx為待測組分魚腥草揮發(fā)油的保留時(shí)間;TRn和TRn+1為正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間;n和n+1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù);TRn

1.2.3 魚腥草揮發(fā)油抗氧化活性的測定

1.2.3.1 對DPPH自由基的清除作用 實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)略作改動[14],精密稱量4.0 mg DPPH用95%乙醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中,配成濃度為 2×10-4mol/L的DPPH溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。魚腥草揮發(fā)油/BHT用無水乙醇稀釋為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/mL魚腥草揮發(fā)油/BHT待測液,實(shí)驗(yàn)分為樣品組、對照組、空白組。樣品組:取0.2 mL DPPH溶液,加入0.05 mL魚腥草揮發(fā)油/BHT待測液(0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/mL)及0.05 mL乙醇加入具塞試管中,搖勻。在避光條件下反應(yīng)30 min后在517 nm下測定吸光度值A(chǔ)2;對照組:取0.2 mL乙醇,加入0.05 mL魚腥草揮發(fā)油/BHT待測液(0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/mL)及0.05 mL乙醇加入具塞試管中,搖勻。在避光條件下反應(yīng)30 min 后在517 nm下測定吸光度值A(chǔ)1;空白組:測定 0.2 mL DPPH溶液與0.1 mL無水乙醇混合液的吸光度A0,根據(jù)下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

其中:I 表示清除率;A2為 0.2 mL DPPH溶液+0.05 mL魚腥草揮發(fā)油/BHT+0.05 mL乙醇的吸光度值;A1為0.2 mL乙醇+0.05 mL魚腥草揮發(fā)油/BHT+0.05 mL乙醇的吸光度值;A0為 0.2 mL DPPH溶液+0.1 mL乙醇的吸光度值。

1.2.3.2 還原力的測定 實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)略作改動[15-16],測定前將魚腥草揮發(fā)油/BHT用無水乙醇稀釋成1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL濃度的魚腥草揮發(fā)油/BHT待測液。準(zhǔn)確移取1.0 mL 上述已配好的不同濃度的魚腥草揮發(fā)油/BHT待測液于潔凈干燥的試管中,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL(pH=6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL,充分混勻后于50 ℃ 恒溫水浴箱中20 min,取出用流水使其快速冷卻,加入1.0 mL 10%的三氯乙酸,3000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min,取部分上清液0.5 mL,加入0.1%的三氯化鐵溶液0.25 mL,再移取1.75 mL的蒸餾水,充分混勻后反應(yīng)10 min,在吸光度為700 nm處測定其吸光度A。各組均按上述方法重復(fù)測量三次,記錄吸光度值為A。

1.2.3.3 金屬離子螯合能力 實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)略作改動[17],實(shí)驗(yàn)分為樣品組、對照組、空白組。魚腥草揮發(fā)油/乙二胺四乙酸二鈉用無水乙醇/雙蒸水稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/mL濃度的魚腥草揮發(fā)油/乙二胺四乙酸二鈉待測液。操作步驟:樣品組:取0.2 mL不同濃度的魚腥草揮發(fā)油/乙二胺四乙酸二鈉待測液于10 mL EP管中,分別加入50 μmol/L的FeSO4溶液0.2 mL和0.15 mol/L的NaCl溶液1.4 mL,再加入300 μmol/L的菲啰嗪0.2 mL后,渦旋混勻5 s,室溫放置10 min,在562 nm處測定的吸光值為A2?？瞻捉M:用上述NaCl溶液代替菲咯嗪,測定吸光度A1。對照組:用蒸餾水代替魚腥草揮發(fā)油/乙二胺四乙酸二鈉待測液,測定對照管吸光度為A0。根據(jù)公式計(jì)算樣品對金屬鐵離子的螯合活性。

其中:I金屬鐵離子的螯合活性;A2為樣品組的吸光度值;A1為空白組的吸光度值;A0為對照組的吸光度值。

1.2.4 魚腥草揮發(fā)油對DOX致大鼠心肌損傷的影響

1.2.4.1 魚腥草揮發(fā)油對DOX誘導(dǎo)的心肌損傷模型的建立 實(shí)驗(yàn)分組(每組10只):生理鹽水組(Control)、DOX組(DOX)、揮發(fā)油25 mg/kg+DOX組(HHO-25)、揮發(fā)油50 mg/kg+DOX組(HHO-50),揮發(fā)油100 mg/kg+DOX組(HHO-100)、VE 500 mg/kg+DOX組(VE);魚腥草揮發(fā)油的劑量參照文獻(xiàn)[18-19]。揮發(fā)油及VE處理:精密量取揮發(fā)油,以吐溫-80作乳化劑,將其溶于生理鹽水中,配成含0.5%吐溫-80的揮發(fā)油儲備液,臨用前將母液稀釋至適宜的濃度。揮發(fā)油低中高劑量分別為25、50和25 mg/kg。模型建立[20]:實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)一周后,開始建立DOX心肌損傷模型,第1 d,生理鹽水組和DOX組灌胃生理鹽水,其他組灌胃相對應(yīng)的魚腥草揮發(fā)油或VE;第2 d,DOX組,揮發(fā)油低劑量+DOX組,揮發(fā)油中劑量+DOX組,揮發(fā)油高劑量+DOX組,VE+DOX組腹腔注射DOX 20 mg/kg,生理鹽水組注射同劑量的生理鹽水;第3和4 d灌胃方式與第1 d相同。第5 d眼球取血,處死大鼠,取腸內(nèi)容物和心臟組織。

1.2.4.2 大鼠體質(zhì)量的測定 動物房內(nèi)溫度維持在(22±2) ℃,濕度維持在55%±5%。模型建立開始前SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周,期間取食飲水自由,同時(shí)采用調(diào)節(jié)燈光的照明時(shí)間來達(dá)到12 h晝、12 h夜交替的條件。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)一周后,模型建立第一天開始每天稱重,記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.2.4.3 大鼠全血血常規(guī)的測定 參照文獻(xiàn)[21],實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對大鼠進(jìn)行摘眼球取血,將全血滴在含EDTA抗凝采血管中,充分混勻后,使用全自動血細(xì)胞分析儀(system-800i)進(jìn)行血常規(guī)檢查,并記錄血液中白細(xì)胞和血小板。

1.2.4.4 心臟組織HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集心臟,生理鹽水洗凈,濾紙吸取表面殘液,縱切取一半心臟組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定。制作心臟組織HE染色,切片脫蠟、切片復(fù)水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片,再用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.4.5 血清中LDH活力的測定 對大鼠進(jìn)行摘眼球取血,室溫靜置2 h,室溫3000 r/min離心10 min,收集血清。然后使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量;使用LDH試劑盒測定LDH活力(U/L)。

1.2.4.6 心臟組織CAT和MDA的測定 分離大鼠心臟,制備10%心肌組織勻漿,嚴(yán)格按照CAT和MDA試劑盒說明書檢測CAT活力和MDA含量,并使用BCA蛋白定量測定法檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.4.7 大鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸(SCFAs)的測定 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:參照Hu等[22]已建立的色譜分析條件和方法,稱取適量乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸等標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中,定容混勻,配置成梯度混合溶液,根據(jù)對應(yīng)質(zhì)量濃度的色譜圖,計(jì)算數(shù)據(jù)并繪制短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。SCFAs的測定:準(zhǔn)確稱取100 mg盲腸內(nèi)容物,冰浴操作,加入超純水(1∶9 w/v),渦旋致充分混勻,置于超聲儀超聲10 min后,再冰浴靜置15 min,離心(4800 g,4 ℃)20 min后吸取上清液,過0.22 μm水系濾膜,用于Agilent 7890B氣相色譜儀測定,導(dǎo)出樣品對應(yīng)SCFAs峰面積,根據(jù)短鏈脂肪酸峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中脂肪酸的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(M±SD)的形式表示,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05時(shí),表示與比較組存在顯著差異,P<0.01表示與比較組差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草揮發(fā)油GC-MS化學(xué)成分鑒定

正構(gòu)烷烴與魚腥草揮發(fā)油的總離子流色譜圖見圖1，確定魚腥草揮發(fā)油中28種化學(xué)成分,魚腥草揮發(fā)油的成分種類非常復(fù)雜,分析結(jié)果見表1。萜類化合物為揮發(fā)油的主要成分,具有消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、及抗腫瘤等生物活性[23]。本文將28種揮發(fā)性組分進(jìn)行分類,其中單萜有:(-)-4-萜品醇、α-松油醇、橙花醇、乙酸龍腦酯;倍半萜:石竹烯和氧化石竹烯;非萜類化合物:正壬醇、癸醛、壬酸、甲基正壬酮、十一醇、癸酸甲酯、正癸酸、十二酮、十一烷酸、十三酮、正十二烷酸、Espatulenol、十四酸、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、3,5,11,15-四甲基-3-十六烯醇、棕櫚酸、棕櫚酸正壬酯、十八醇、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸甲酯、(E)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、亞麻酸、硬脂酸。用面積歸一法計(jì)算各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量,鑒定的主要成分有癸酸(35.63%)、棕櫚酸(22.64%)、甲基正壬酮(10.42%)和乙酸龍腦酯(9.95%)等。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24],用水蒸氣蒸餾法鑒定出的魚腥草揮發(fā)油的主要成分有:甲基正壬酮、癸酸和乙酸龍腦酯等,和本實(shí)驗(yàn)鑒定出的主要成分相似,但主要成分含量有一定的差異,可能與產(chǎn)地、采收季節(jié)和存儲時(shí)間有關(guān)。

表1 魚腥草中揮發(fā)油化學(xué)成分及百分含量 Table 1 Chemical constituents and content of Heartleaf houttuynia herb essential oil

圖1 正構(gòu)烷烴、魚腥草揮發(fā)油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatography of the n-alkane and Heartleaf houttuynia herb essential oil注:A：正構(gòu)烷烴的總離子流色譜圖；B：魚腥草揮發(fā)油的總離子流色譜圖。

2.2 魚腥草揮發(fā)油抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對DPPH自由基的清除作用 考察了魚腥草揮發(fā)油在質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/mL的DPPH自由基清除能力,并與陽性對照BHT作對比。結(jié)果表明,魚腥草揮發(fā)油具有良好的清除DPPH自由基能力,且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系如圖2所示,其清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高而增大。

圖2 DPPH自由基清除作用Fig.2 DPPH free radical scavenging effect

2.2.2 還原力的測定 測得吸光度的值大小決定化合物還原力的強(qiáng)弱,如圖3所示,當(dāng)濃度為1～5 mg/mL時(shí),魚腥草揮發(fā)油對Fe3+的還原力隨著濃度的增加而明顯升高,說明該樣品的還原力具有較強(qiáng)的濃度依賴性,可知魚腥草揮發(fā)油具有較強(qiáng)的還原力。

圖3 還原力的測定Fig.3 Reduction force determination

2.2.3 金屬離子螯合能力 如圖4所示,當(dāng)濃度為0.5～4 mg/mL時(shí),魚腥草揮發(fā)油對亞鐵離子螯合能力隨著濃度的增加而明顯升高,當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí),達(dá)到最大值,可知魚腥草揮發(fā)油具有很好的螯合亞鐵離子能力。

圖4 金屬離子螯合能力Fig.4 Chelating ability of metal ions

2.3 魚腥草揮發(fā)油對DOX致大鼠心肌損傷的影響

2.3.1 揮發(fā)油對DOX致心肌損傷大鼠體質(zhì)量的影響 在心肌損傷過程中,大鼠體重變化情況是反映其健康狀況的重要指標(biāo)之一。體質(zhì)量變化如圖5所示,圖5A是模型建立第1 d和第5 d的大鼠體質(zhì)量,可以看出給予DOX的各組(DOX組、VE組、魚腥草揮發(fā)油-25、-50、和-100組)大鼠體重均降低,圖5B可以看出,模型組與正常組相比,大鼠體質(zhì)量有極顯著差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中,正常組大鼠體質(zhì)量增加,而模型組體質(zhì)量降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)最后DOX組、VE組、魚腥草揮發(fā)油-25、-50、和-100組的組間體重變化無顯著性差異。這些結(jié)果表明DOX可引起體質(zhì)量的下降,給予魚腥草揮發(fā)油后對DOX引起的體重變化無顯著影響。

圖5 大鼠體質(zhì)量的變化Fig.5 Changes of body mass in rats注:圖A為第1 d和第5 d體質(zhì)量；圖B為第1 d和第5 d體質(zhì)量差。與對照組比較,##表示P<0.01。

2.3.2 揮發(fā)油對DOX致心肌損傷大鼠血常規(guī)的影響 數(shù)據(jù)顯示,與正常組相比,大鼠給予DOX后,表現(xiàn)為血小板及白細(xì)胞極顯著減少(圖6)。與模型組相比,大鼠給予魚腥草揮發(fā)油后,各組白細(xì)胞和血小板有所上升,但無顯著性差異,VE組血小板含量顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果提示,魚腥草揮發(fā)油對DOX引起的血生化紊亂無顯著保護(hù)作用。

圖6 大鼠血常規(guī)指標(biāo)Fig.6 The routine index of rat blood注:圖A為白細(xì)胞的含量；圖B為血小板的含量。與對照組比較,##表示P<0.01;與模型組相比,*表示P<0.05。

2.3.3 揮發(fā)油對DOX致心肌損傷大鼠心臟微觀結(jié)構(gòu)的影響 心臟組織的組織病理學(xué)檢查是為了進(jìn)一步說明DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。

本實(shí)驗(yàn)利用HE染色的方式,利用倒置顯微鏡觀察心臟組織切片病理結(jié)構(gòu),觀察視野如圖7所示,正常組顯示了正常心肌束的結(jié)構(gòu),心臟結(jié)構(gòu)整齊,心肌纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰且正常。模型組心肌纖維明顯斷裂,心肌細(xì)胞有腫脹反應(yīng),結(jié)構(gòu)破壞較明顯;而與模型組相比,揮發(fā)油低中高劑量組和陽性對照VE組心肌纖維排列明顯整齊,纖維斷裂減少,心臟結(jié)構(gòu)趨于完整。綜上所述,魚腥草揮發(fā)油能有效促進(jìn)DOX誘導(dǎo)的心肌損傷模型大鼠中心臟組織形態(tài)趨于正?；?具有心肌保護(hù)作用。

圖7 大鼠心臟組織切片病理學(xué)觀察(HE,×40)Fig.7 Pathological observation of rat heart biopsy(HE,×40)

2.3.4 魚腥草揮發(fā)油對DOX損傷的心肌細(xì)胞的影響 乳酸脫氫酶(LDH)是一種常見的心肌酶,它能催化乳酸和丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)化[47],其作為心肌診斷的標(biāo)記物廣泛應(yīng)用于心肌損傷研究中。從表2可以看出,經(jīng)DOX處理過的大鼠,其血清中LDH活力顯著高于正常對照組(P<0.05),說明DOX對大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重;而與模型組相比,VE陽性對照LDH活力降低(P<0.05),同時(shí),給予魚腥草揮發(fā)油各組LDH的活力降低,隨揮發(fā)油劑量的增加而下降,魚腥草揮發(fā)油高劑量組(P<0.05)效果最好。

表2 大鼠體內(nèi)CAT、MDA和LDH的含量Table 2 Contents of CAT，MDA and LDH in rats

2.3.5 心臟組織CAT和MDA的測定 CAT能將H2O2分解成H2O和O2,使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH,MDA是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物。如表2所示,與正常對照組相比,模型組大鼠心臟組織中CAT活性降低(P>0.05),而MDA含量升高(P<0.05);與模型組相比,中和高劑量組大鼠心臟組織中CAT活性上升(P<0.05),同時(shí)伴隨著MDA含量下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外,VE組MDA含量顯著降低且CAT活性顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果提示魚腥草揮發(fā)油的心肌保護(hù)作用與其提高大鼠抗氧化防御能力有關(guān)。

2.3.6 魚腥草揮發(fā)油對大鼠腸道中SCFAs的影響 SCFAs是指碳原子數(shù)目不大于6的脂肪酸,在腸道中以乙酸、丙酸和異丁酸含量居高。在生物體內(nèi)SCFAs能夠提供能量、調(diào)節(jié)免疫功能且對腸道細(xì)胞代謝起調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs的含量如圖8所示。與正常組相比,DOX組中乙酸、丙酸和正戊酸的濃度極顯著下降(P<0.01)。與模型組相比,VE組異丁酸和異戊酸含量極顯著增加(P<0.01)。然而,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與模型組相比,魚腥草揮發(fā)油各組中SCFAs的含量無顯著差異,顯示該揮發(fā)油對SCFAs無顯著調(diào)控作用。

圖8 魚腥草揮發(fā)油對DOX誘導(dǎo)性心肌損傷大鼠盲腸內(nèi)容物SCFAs的影響Fig.8 Effect of HHO on SCFAs of caecum contents in dox-induced myocardial injury in rats注:A為乙酸的濃度,B為丙酸的濃度,C為異丁酸的濃度,D為異戊酸的濃度,E為正戊酸的濃度;與正常組相比:#表示P<0.05,##表示P<0.01;與模型組相比:**表示P<0.01。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過水蒸氣蒸餾法提取魚腥草揮發(fā)油,GC-MS化學(xué)成分鑒定顯示含有28種物質(zhì),含有萜類化合物、酯類化合物、烯烴、醇類化合物等。據(jù)報(bào)道,魚腥草揮發(fā)油的成分主要有甲基正壬酮、月桂烯、月桂醛、葵醛和癸酸[24],而本試驗(yàn)所提取的魚腥草揮發(fā)油未見月桂烯和月桂醛成分,這可能與產(chǎn)地、氣候、土壤、采收季節(jié)、加工方法、儲存時(shí)間、曬干粉碎程度等因素有關(guān)。呂都等[48]報(bào)道了魚腥草揮發(fā)油的抗氧化活性;通過魚腥草揮發(fā)油對清除DPPH自由基、還原力的測定和鐵離子螯合能力的測定,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了魚腥草揮發(fā)油具有較好的抗氧化活性。查麗[49]發(fā)現(xiàn)新魚腥草素鈉注射液則能清熱解毒、活血化瘀,為抗病毒、消炎、解熱之有效藥物,且能促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能,抗氧自由基損傷,抗血小板聚集,保護(hù)心肌細(xì)胞。然而,魚腥草揮發(fā)油對DOX導(dǎo)致的心肌損傷是否有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射DOX建立大鼠心肌損傷模型,研究魚腥草揮發(fā)油對DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷的影響。

LDH作為心肌損傷的標(biāo)志酶,在心肌損傷的進(jìn)程中,表現(xiàn)為血清中LDH水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,DOX組的大鼠血清中LDH的活性顯著增加,表明大鼠的心肌受損。HE形態(tài)學(xué)觀察顯示大鼠腹腔注射DOX后,心肌正常結(jié)構(gòu)遭到破壞。然而,DOX建立心肌損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪^程中,同時(shí)給予魚腥草揮發(fā)油處理后,與DOX組相比,大鼠血清中LDH活性顯著下降,并且HE形態(tài)學(xué)觀察顯示魚腥草揮發(fā)油能抑制DOX引起的心肌形態(tài)改變,使心肌的形態(tài)趨于正常化。這些表明魚腥草揮發(fā)油對DOX導(dǎo)致的大鼠心肌損傷具有一定的保護(hù)作用,能減輕DOX介導(dǎo)的心臟毒性。

DOX引起心臟毒性的作用機(jī)制較為復(fù)雜,涉及到多種途徑的共同作用與相互影響。在當(dāng)前的研究中,以自由基反應(yīng)為基礎(chǔ)的氧化應(yīng)激學(xué)說被認(rèn)為是DOX致心臟毒性的重要機(jī)制[50]。于靜等[51]表明具有抗氧化等作用的中藥都可能對防治DOX心臟毒性有一定效果。本研究中MDA的數(shù)據(jù)顯示,與正常組相比,DOX組中MAD含量顯著增加,其抗氧化物酶CAT活性顯著下降。進(jìn)一步數(shù)據(jù)顯示,魚腥草揮發(fā)油處理大鼠后,可增加大鼠心肌組織的抗氧化防御能力,減少M(fèi)DA的含量,抑制DOX介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的形成。同時(shí),VE具有很強(qiáng)的抗氧化性,本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示大鼠給予VE后,可減輕DOX導(dǎo)致心肌組織的氧化應(yīng)激,具有心肌保護(hù)作用。結(jié)合前期體外抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示,魚腥草揮發(fā)油具有較好的抗氧化能力,這些數(shù)據(jù)表明魚腥草揮發(fā)油的心肌保護(hù)作用的作用機(jī)理與自身的抗氧化能力密不可分。最后,根據(jù)前人研究[48,52]和本實(shí)驗(yàn)中的GC-MS化學(xué)成分分析,提示魚腥草揮發(fā)油的抗氧化能力與該揮發(fā)油中主要成分有萜類化合物、脂類化合物、烯烴及醇類化合物有關(guān)。此外,已有研究發(fā)現(xiàn)除了抗氧化活性,魚腥草揮發(fā)油被證實(shí)具有抗炎以及調(diào)節(jié)血脂等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[49]。眾所周知,心血管疾病的病因隱匿,病程復(fù)雜,因此魚腥草揮發(fā)油的心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)理及其靶標(biāo)仍需進(jìn)一步研究。最近,腸道微生物相關(guān)的研究掀起了新熱潮,科學(xué)家在做抗腫瘤毒副作用研究的同時(shí),已證實(shí)DOX對腸道內(nèi)環(huán)境的危害[53]。因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步開展了腸道的微生物關(guān)鍵代謝產(chǎn)物SCFAs的含量研究,與正常組相比,模型組乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸的濃度顯著降低,表明DOX可引起大鼠腸道功能的下降。與模型組相比,魚腥草揮發(fā)油各組中SCFAs含量略有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。探究其原因:a.可能沒有腸道保護(hù)作用;b.魚腥草揮發(fā)油不屬于膳食纖維,且分子量不大,在腸道中停留的時(shí)間很短;另一方面魚腥草揮發(fā)油在體內(nèi)產(chǎn)生的生物效能,在各個(gè)臟器中的時(shí)間周期性具有差異;本實(shí)驗(yàn)周期為4 d,有可能在短時(shí)間內(nèi)不能高效調(diào)控SCFAs的生成。

總而言之,魚腥草揮發(fā)油對DOX所致的大鼠心肌損傷有一定的保護(hù)作用,究其原因與魚腥草揮發(fā)油能有效降低心肌組織氧化應(yīng)激,提高抗氧化防御功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對魚腥草揮發(fā)油開發(fā)成為新一代的防治疾病尤其是針對心血管和腫瘤的功能食品將有重要的應(yīng)用價(jià)值,而且也對詮釋魚腥草的心肌保護(hù)作用有著非常積極的意義。