楊海艷1,2,趙天明,張顯權(quán)2,郭 航2,張 振

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州貴陽 550003)

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire),為姜科豆蔻屬多年生草本植物。干燥成熟果實(shí)屬于我國傳統(tǒng)的藥食同源植物[1];主要種植于熱帶和亞熱帶林下的重要經(jīng)濟(jì)作物,廣泛分布于云南、貴州、廣西等3省區(qū),是我國草果的主產(chǎn)區(qū)[2]。干草果在食品加工中可作為調(diào)味品使用,能夠去除牛、羊、魚肉的膻腥氣味;其干燥成熟果實(shí)入藥具有燥濕溫中、健胃清食、除痰截瘧等功效[3-4]。草果提取的精油具有減肥降脂降糖[5]、抗腫瘤[6]、抑菌[7,8]、抗氧化[9-10]、促進(jìn)藥物滲透吸收[11]、果蔬保鮮[12]、抗炎和保護(hù)神經(jīng)[13-14]等功效。

草果全株皆含揮發(fā)油,主要為萜烯類化合物。相關(guān)報道指出不同產(chǎn)地的草果揮發(fā)油主成分相似,但含量存在差異[15],馬潔等[16]對云南省西雙版納林帶內(nèi)采集的4個地區(qū)草果的15種精油成分進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)4種不同草果的化學(xué)成分含量均存在一定差異;而趙怡等[17]研究發(fā)現(xiàn)廣西和云南產(chǎn)草果精油主要的成分存在差異,桂、滇兩地產(chǎn)的草果揮發(fā)油中,倍半萜烯類組、萜醛和萜醇類組分相對含量較高,且產(chǎn)地不同化學(xué)成分含量差異較大。黔產(chǎn)草果揮發(fā)油成分的相關(guān)研究鮮有報道,此外目前草果精油的研究主要是提取工藝和功能性研究,對于草果不同部位的精油成分分布尚不清楚。

因此,本課題組從貴州省草果重要產(chǎn)地畢節(jié)市納雍縣采集草果花、莖葉和根,采用水蒸氣蒸餾法分別提取草果花、莖葉和根等部位的精油,分析其不同部位精油的化學(xué)組分,并比較不同部位的抗氧化活性,以期為黔產(chǎn)草果的合理開發(fā)利用提供理論支撐和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果花、草香莖葉、草香根 采自貴州省畢節(jié)市納雍縣余家田壩村;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,純度97%) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪,純度≥99%)、Torlox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸,純度≥97%) 上海麥克林生化科技有限公司;ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽,純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;PBS緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;甲醇、鹽酸、K2S2O8、氯化鐵、醋酸鈉、醋酸 以上試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;UH5300型可見分光光度 日立制作所株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物精油的提取 分別稱取100 g自然風(fēng)干草果花、莖葉和根,剪碎,置于2000 mL圓底燒瓶中加入1600 mL去離子水;放置在升降臺上,采用螺旋夾固定冷凝裝置后,將圓底燒瓶放置在電熱套上進(jìn)行加熱蒸餾,冷凝管回流提取并收集揮發(fā)的油性物質(zhì),當(dāng)?shù)玫降挠托晕镔|(zhì)無變化后停止加熱提取,冷卻后打開分液漏斗去除蒸餾水,同時收集提取得到的精油,置于分析天平上準(zhǔn)確稱取精油質(zhì)量,然后裝入棕色玻璃瓶中,置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

式中:m表示精油的質(zhì)量,g;M表示提取物的質(zhì)量,g。

1.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件:SH-Rxi-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm,5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷),升溫程序:50 ℃,以10 ℃/min升到110 ℃,再以1 ℃/min升到140 ℃,再以10 ℃/min升到250 ℃,進(jìn)樣口溫度250 ℃,分流比:50∶1,進(jìn)樣量:1 μL。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI);能量:70 eV;進(jìn)樣口溫度:230 ℃,接口溫度:260 ℃;溶劑延遲:8 min;掃描范圍:10～550 u。

RI值的測定:取C8～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品,以正己烷為溶劑配制濃度為0.1%的溶液,采取上述分析條件進(jìn)行分離,測定各正烷烴的保留時間。各成分的RI值根據(jù)Kovats公式進(jìn)行計算。

式中:RI為被分析組分的保留指數(shù);tx為被分析組分流出峰的保留時間(min);tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時間(min);tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正烷烴流出峰的保留時間(min),且tn

定性定量方法:草果揮發(fā)油經(jīng)過GC-MS分析后,通過NIST17-1.lib、NIST17-2.lib、NIST17s.lib、FFNSC1.3.lib質(zhì)譜庫進(jìn)行自動檢索,然后將測定的保留指數(shù)值與精油數(shù)據(jù)庫中的保留指數(shù)進(jìn)行比對,物質(zhì)成分定性指標(biāo)為質(zhì)譜庫相似度≥90%,化合物保留指數(shù)的文獻(xiàn)值與實(shí)驗(yàn)值相差10以內(nèi),色譜峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

1.2.3 植物精油抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH自由基消除能力的測定 DPPH自由基清除活性參照Brand-Williams等[18]的方法稍作修改進(jìn)行測定。將每種精油20 mg溶解于1.00 mL甲醇溶液中,制得20 mg/mL精油溶液。測定前,用甲醇配制0.024 mg/mL的DPPH溶液。吸取150 μL待測樣品,加入6 mL DPPH溶液,置于避光室內(nèi)靜置30 min,甲醇作為空白,于515 nm處分別測定吸光值,精油樣品加DPPH溶液測定的吸光值為A0,甲醇樣品加DPPH溶液測定的吸光值為A1,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。植物精油DPPH自由基的清除能力計算公式如下。

通過Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid)換算出被測物質(zhì)抗氧化能力的大小,Trolox是一種維生素E的類似物可以作為對照標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果采用Trolox的濃度來表示。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參照Xu等[19]的方法進(jìn)行測定。將每種精油20 mg溶解于1.00 mL甲醇溶液中,制得20 mg/mL精油溶液。分別吸取精油樣品50 μL于試管中,加入4 mL ABTS溶液,混勻,將配制好的溶液于室內(nèi)避光靜置3 min,甲醇作為空白,于515 nm處分別測定吸光值,標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品加ABTS溶液測定的吸光值為A0,甲醇樣品加ABTS溶液測定的吸光值為A1,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果采用Trolox的濃度來表示。

1.2.3.3 FRAP三價鐵還原能力的測定 Fe3+還原能力的測定參考Dinis等[20]的方法。分別吸取精油樣品150 μL于試管中,首先分別加入450 μL蒸餾水,混勻,接著加入4.5 mL事先預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液,將配制好的溶液于水浴鍋內(nèi)避光反應(yīng)15 min,甲醇作為空白,于593 nm下測定吸光值,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果采用Trolox的濃度來表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,利用Duncan’s新復(fù)極差法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果不同部位精油的提取率

由圖1可知,黔產(chǎn)草果不同部位的精油提取率均低于1%,其中草果根的精油提取率最高,達(dá)到0.79%;其次為草果花,提取率為0.66%;最低為草果莖葉,提取率只有0.35%。且草果花、根和莖葉之間的提取率差異極顯著(P<0.01)。草果根精油提取率相對最高,是草果莖葉精油提取率的2.2倍。

圖1 草果不同部位精油提取率Fig.1 Extraction rate of essential oil from different parts of Amomum tsaoko注:小寫字母表示同一指標(biāo)不同部位間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);圖6同。

2.2 草果不同部位精油GC-MS分析結(jié)果

草果不同部位精油的總離子流圖如圖2～4所示,通過計算機(jī)工作站與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索,化合物通過保留指數(shù)進(jìn)行定性,峰面積歸一化法進(jìn)行定量,分別確定了草果花、根、莖葉的揮發(fā)性化學(xué)組成成分,經(jīng)鑒定,草果不同部位精油共檢測到42種組分,所檢測到的不同部位精油成分的化學(xué)分類見表1。

表1 草果不同部位揮發(fā)油中主要特征性揮發(fā)化合物的比較分析Table 1 Comparative analysis of the main characteristic volatile compounds in the volatile oil of different parts of Amomum tsaoko

圖2 草果花精油成分總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart(TIC)of essential components from the flowers of Amomu tsaoko

圖3 草果根精油成分總離子流圖Fig.3 Total ion flow chart(TIC)of essential oil components from the roots of Amomum tsaoko

圖4 草果莖葉精油成分總離子流圖Fig.4 Total ion flow chart(TIC)of essential oil components from the leaf of Amomum tsaoko

2.2.1 草果花精油成分 從草果花精油共鑒定出26種物質(zhì),總相對含量為98.87%。主要為單萜類化合物(68.83%)、含氧單萜類化合物(18.89%)、倍半萜類化合物(1.33%)、含氧倍半萜類化合物(3.64%)、芳香族化合物(5.28%)、其它化合物(0.9%)。其中相對含量超過2%的組分有11種,分別是β-蒎烯(33.42%)、α-蒎烯(11.28%)、桉葉油醇(9.46%)、莰烯(2.82%)、檜烯(4.79%)、水芹烯(6.74%)、P-傘花烴(5.08%)、檸檬烯(4.10%)、異龍腦(3.75%)、4-萜品醇(2.02%)、反式-橙花叔醇(2.04%)。

2.2.2 草果根精油成分 從草果根莖葉共鑒定出25種物質(zhì),總相對質(zhì)量99.75%。主要為單萜類化合物(49.78%)、含氧單萜類化合物(41.39%)、倍半萜類化合物(0.16%)、含氧倍半萜類化合物(5.34%)、芳香族化合物(1.06%)、其它化合物(2.02%)。其中相對含量超過2%的組分油8種,分別是α-蒎烯(8.20%)、β-蒎烯(34.84%)、桉葉油醇(15.97%)、芳樟醇(16.31%)、4-萜品醇(2.16%)、α-松油醇(5.42%)、乙酸松油酯(2.02%)、反式-橙花叔醇(3.45%)。

2.2.3 草果莖葉精油成分 從草果莖葉精油共鑒定出34種物質(zhì),總相對質(zhì)量為97.56%。主要為單萜類化合物(37.59%)、含氧單萜類化合物(12.07%)、倍半萜類化合物(37.51%)、含氧倍半萜類化合物(4.40%)、芳香族化合物(1.74%)、其它化合物(4.25%)。其中相對含量超過2%的組分有10種,分別是α-蒎烯(4.89%)、檜烯(2.89%)、β-蒎烯(21.56%)、水芹烯(2.89%)、檸檬烯(2.86%)、桉葉油醇(8.07%)、左旋乙酸冰片酯(3.58%)、石竹烯(13.77%)、α-律草烯(17.24%)、α-柏木烯(2.10%)。

2.2.4 草果不同部位精油成分的分析比較 草果花、根和莖葉中單萜類化合物和含氧單萜類化合物含量較多。草果花精油中單萜類化合物含量最高,占總含量的68.83%,β-蒎烯、α-蒎烯含量達(dá)到33.42%、11.28%。草果根精油中單萜類化合物和含氧單萜類化合物含量差異不大,分別占總含量的49.78%、41.39%,β-蒎烯、芳樟醇和桉葉油醇含量達(dá)到34.84%、16.31%和15.97%。草果莖葉精油中單萜類化合物和倍半萜類化合物的含量和種類最多,占總含量的37.59%和37.51%,倍半萜類化合物有11種,石竹烯、α-律草烯含量分別達(dá)到13.77%和17.24%。研究表明從云南采集的31批草果莖、葉揮發(fā)油進(jìn)行提取并分析主要化學(xué)成分結(jié)果可知,草果莖、葉揮發(fā)油主要化學(xué)成分為桉葉油醇、α-蒎烯、β-蒎烯和D-檸檬烯,四種組分含量可達(dá)揮發(fā)油總量的80%左右[21]。Cui等[22]從草果精油中共鑒定出34種化合物,其中1,8-桉樹腦含量最高,占精油總成分的37.8%。α-水芹烯、P-對丙基苯甲醛和β-蒎烯分別占總成分的5.4%、5.5%和3.8%,與本結(jié)果基本一致。

結(jié)合圖5和表1可以看出,草果不同部位提取的3種精油具有相同的化合物19種,各成分含量在不同部位中的含量存在一定差別,其中,蒎烯類化合物(α-蒎烯和β-蒎烯)是草果花、根、莖葉精油中含量最高的化合物,花(44.70%)>根(43.04%)>莖葉(26.45%)。α-蒎烯和β-蒎烯具有松木香和樹脂香,是草果不同部位精油的主要呈香物質(zhì)[23],α-蒎烯和β-蒎烯具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗胃潰瘍、抗郁抑癥、抗氧化、鎮(zhèn)痛等生物及醫(yī)藥活性[24];草果不同部位精油中水芹烯含量花(6.74%)>莖葉(2.89%)>根(0.67),水芹烯具有柑橘香、藥草香和青草香[24],且具有抗菌抗炎的生物活性[25];石竹烯的含量莖葉(13.77%)>花(1.15%)>根(0.16%),主要呈現(xiàn)木香、甜香和辛香,具有抗炎、驅(qū)蚊蟲、抗焦慮、鎮(zhèn)咳祛痰等功效[26];桉葉油醇的含量根(15.97%)>花(9.46%)>莖葉(8.07%),具有治療呼吸道感染、抗氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛等作用[27]。

圖5 草果不同部位精油各類組分的含量差異對比Fig.5 Comparison of different components of essential oil in different parts of Amomum tsaoko

草果花精油中特有的化合物為萜品油烯(1.04%)、反式-松香芹醇(1.00%)和P-傘花烴(5.08%),萜品油烯主要呈現(xiàn)松木香和甜香,具有抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)痛和抗炎等活性[28];草果根精油中特有的化合物為鄰-異丙基苯(0.91%),纈草萜烯醇(0.12%)。此外草果根精油中芳樟醇含量為16.31%,遠(yuǎn)高于草果莖葉精油中的含量,芳樟醇具有青香、木香和甜香的強(qiáng)烈氣味[24],是草果精油中主要呈香物質(zhì)之一,且具有抗菌、抗炎、抗癌、降血脂和鎮(zhèn)痛等作用[29];草果莖葉精油中特有化合物主要為倍半萜類,有9種,其中α-律草烯含量達(dá)17.24%,其次是芳香族化合物4-異丙基甲苯(0.19%)和其他類化合物左旋乙酸冰片酯(3.58%)。因此各精油中組分的差異以及各組分相對含量的不同,會導(dǎo)致其生物活性和藥理功能存在差異。

2.3 草果不同部位精油抗氧化能力評價

由圖6可知,草果根的DPPH自由基清除能力較強(qiáng),草果花和草果莖葉提取的精油的DPPH自由基清除能力較差,草果根的DPPH自由基清除能力分別比草果花和草果莖葉的清除能力高46.14%和52.25%,說明草果根是三者中DPPH自由基清除能力最強(qiáng);草果的ABTS+自由基清除能力較強(qiáng)的為草果花和莖葉,兩者無顯著差異,草果根的ABTS+自由基清除能力最弱。與草果根相比,草果花和草果莖葉分別比草果根高出31.19%和28.97%。草果的FRAP還原能力最強(qiáng)的為莖葉,其次是草果花,最后為草果根,草果花和草果莖葉的FRAP還原能力分別比草果根高出34.88%和62.11%。其中對Fe3+還原能力明顯高于對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率,與文獻(xiàn)比較差距較大。郭淼等[30]研究發(fā)現(xiàn)草果精油清除DPPH自由基、ABTS自由基及絡(luò)合Fe3+能力較強(qiáng),研究發(fā)現(xiàn)草果精油在濃度2～10 mg/mL的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率及Fe3+絡(luò)合率都隨著提取物的濃度增加而增大的變化趨勢,但2 mg/mL草果精油清除ABTS+自由基效果好于同濃度的BHT。孟大威等[31]對比了兩種提取方法得到的草果精油對DPPH自由基的清除率,結(jié)果表明當(dāng)精油濃度在10 mg/mL時,其清除率達(dá)到最大,水蒸氣蒸餾-乙醚萃取法所得精油清除率為80.00%,采用Cleveger法研究所得的精油清除率為75.80%;韓林等[32]發(fā)現(xiàn)草果精油對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力較強(qiáng)的清除能力,對DPPH自由基的EC50為3.84 mg/mL,對ABTS+自由基的EC50為3.20 mg/mL。

圖6 草果不同部位精油抗氧化能力評價Fig.6 Evaluation of antioxidant capacity of essential oils in different parts of Amomum tsaoko

3 結(jié)論

以水蒸氣蒸餾法提取黔產(chǎn)草果不同部位精油,其中草果根的精油提取率最高,其次為草果花,最低為草果莖葉。草果花、根、莖葉精油中分別鑒定出26、25和34種化合物,占各自精油總量的98.87%、99.75%和97.56%。三個部位具有相同化合物19種,分別占各部位精油種類總量的90.7%、67.05%和80.79%。草果花特有3種化合物,占總相對含量7.12%;草果根特有2種,占總相對含量1.03%;草果莖葉特有11種,占總相對含量26.28%,草果不同部位精油中組分的差異以及各組分相對含量的不同,導(dǎo)致其生物活性和藥理功能存在差異,因此在以后的研究和研發(fā)中,應(yīng)根據(jù)需求選擇適合的草果植株部位。

對草果精油不同部位提取的精油進(jìn)行抗氧化性實(shí)驗(yàn)測定,均具有一定的抗氧化活性,其中草果根精油對DPPH自由基的清除能力最高為(11.79±0.73) μmol Trolox/g;草果花精油對ABTS自由基的清除能力最高為(112.96±1.22) μmol Trolox/g;草果莖葉精油對Fe3+的還原能力最高為(77.91±0.38) μmol Trolox/g。說明草果不同部位精油具有較強(qiáng)的抗氧化能力,此實(shí)驗(yàn)為草果精油中化學(xué)活性物質(zhì)的開發(fā)提供了重要依據(jù)。