金玉潔,何國(guó)慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于乳桿菌科乳桿菌屬,是一種同型發(fā)酵乳酸菌,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,不產(chǎn)芽孢,且兼性厭氧,具有很強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力,較耐鹽、耐酸[1]。其最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃,最適pH在6.5左右,在MRS培養(yǎng)基中菌落形態(tài)均為白色圓形凸起菌落,有大有小。植物乳桿菌作為一種重要的益生菌,具有改善食品風(fēng)味[2]、增強(qiáng)免疫力[3]、調(diào)節(jié)腸道健康[4]、降低膽固醇[5]、改善焦慮抑郁[6]等功能,在食品發(fā)酵、工業(yè)發(fā)酵及醫(yī)療保健等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。獲得高密度植物乳桿菌對(duì)其商業(yè)化生產(chǎn)具有重要作用。

高密度培養(yǎng)是一個(gè)相對(duì)的概念,通過(guò)一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置使得菌體的發(fā)酵密度較普通培養(yǎng)有顯著性提高,從而提高特定產(chǎn)物的生產(chǎn)率[7]。影響植物乳桿菌生長(zhǎng)的因素有很多,如菌種活力、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)周期、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度以及接種量等[8]。植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)一般采用補(bǔ)料、膜過(guò)濾、細(xì)胞固定化等方式來(lái)減少代謝廢物對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的抑制,提高菌體密度,但這些方法往往較為復(fù)雜且成本較高[9]。相比來(lái)說(shuō),培養(yǎng)基的成分優(yōu)化獲得高密度細(xì)胞是最為經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。梁璋成等[10]采用均勻設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)優(yōu)化植物乳桿菌R23培養(yǎng)基,結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中引入蘋果酸鈉,增菌效果明顯。蔡麗麗等[11]利用響應(yīng)面法對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)基成分中的碳源、緩沖溶劑、氮源進(jìn)行了優(yōu)化,確定最終菌液光密度 OD600最大為 2.0577。郝永偉等[12]對(duì)植物乳桿菌高效培養(yǎng)基碳源進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)蔗糖能部分替代葡萄糖作為碳源,節(jié)約了成本。

根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)特點(diǎn),本文探究了培養(yǎng)基成分對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖的影響,確定了優(yōu)化培養(yǎng)基配方,提高植物乳桿菌的菌體密度,為今后植物乳桿菌高密度發(fā)酵提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ZU018 由浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并鑒定,于15%(V/V)甘油的MRS培養(yǎng)基中-80 ℃凍存,保藏編號(hào)為J-180312;MRS液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L,吐溫80 1.0 mL,pH6.2～6.4,用蒸餾水定容至1000 mL,121 ℃滅菌15 min;MRS固體培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為1.5%～2%的瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min,用于活菌計(jì)數(shù);基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整各組成分的種類及含量。

Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BSA124S電子天平、PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius;YXQ-LS-50 SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;UPR純水儀 西安優(yōu)普(Ulupure)儀器設(shè)備有限公司;SW-CJ-1D超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將甘油凍存的菌種劃線于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中,靜止培養(yǎng)24 h。再以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,活化兩代,即得實(shí)驗(yàn)用活化菌種。

1.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定 發(fā)酵液中活菌數(shù)的測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法,參照陳燕飛[13]的方法。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 碳源及添加量:分別以20 g/L的麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、復(fù)配比為1∶1的蔗糖和葡萄糖(m/m)、D-果糖、山梨醇替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源,2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳碳源;將最佳碳源分別以10、15、20、25、30 g/L的濃度加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳添加量。

氮源及添加量:分別以20 g/L的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源,2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳單一氮源;在此基礎(chǔ)上,將其他有機(jī)氮源分別與最優(yōu)單一氮源進(jìn)行復(fù)配,復(fù)配比為1∶1 (m/m),2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳復(fù)合氮源;將最佳氮源分別以20、30、40、50、60 g/L的濃度加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳添加量;在最佳氮源及添加量的基礎(chǔ)上,選擇1∶2、1∶1、2∶1的氮源復(fù)配比配制培養(yǎng)基,2%接種量,37 ℃下培養(yǎng)18 h,測(cè)定活菌數(shù),確定最佳復(fù)配比。

1.2.3.2 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Fractional factorial design,FFD) 相關(guān)研究表明,磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨作為培養(yǎng)基中的緩沖鹽,與細(xì)胞生物量密切相關(guān)[7],因此,在單因素實(shí)驗(yàn)所篩選出的碳源和氮源的基礎(chǔ)上,選取磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨為緩沖鹽,采用部分因子實(shí)驗(yàn)初步確定培養(yǎng)基中的這些組分對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)影響最為重要的三個(gè)因素,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用Design Expert 10軟件對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),如表1所示。

表1 部分因子實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of FFD

1.2.3.3 最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)(Path of steepest ascent) 基于1.2.3.2篩選出對(duì)活菌數(shù)影響顯著的因素,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與中心點(diǎn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行方差分析檢驗(yàn),若結(jié)果表明不顯著,這說(shuō)明最優(yōu)點(diǎn)不在實(shí)驗(yàn)范圍之內(nèi),需進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),通過(guò)各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)來(lái)確定最陡爬坡試驗(yàn)的路徑(包括變化方向及變化步長(zhǎng)),快速的逼近最大響應(yīng)區(qū)域[14],其中,顯著影響因素以部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的0水平為基礎(chǔ)步移[15]。

1.2.3.4 Box-Behnken Design試驗(yàn)(BBD) 基于1.2.3.2與1.2.3.3,進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),以部分因子實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)具有顯著影響的因素作為設(shè)計(jì)因子,以最陡爬坡路徑試驗(yàn)活菌數(shù)最多時(shí)的變量值作為中心點(diǎn),對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,實(shí)驗(yàn)因素及水平如表2所示。

表2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of BBD

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的偏差,利用優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌ZU018進(jìn)行培養(yǎng),測(cè)定最終活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。采用Design Expert 10.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸分析;采用SAS(Version9.4)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析,P<0.05即認(rèn)為存在顯著性差異;采用Origin8.5.1軟件進(jìn)行繪圖,采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.1.1.1 不同碳源對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響 合適的碳源有利于細(xì)胞的吸收和利用,加快微生物增殖。常見(jiàn)碳源有糖類、低碳醇和油脂等[16],本實(shí)驗(yàn)選取麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇為碳源,研究其對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響。

不同碳源的培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)的影響具有顯著性差異(P<0.05),如圖1所示。麥芽糖作為碳源時(shí),植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)最高,達(dá)到5.68×109CFU/mL。果糖及山梨醇作為碳源時(shí),活菌數(shù)較低。張巖春等[17]發(fā)現(xiàn)果糖為促進(jìn)植物乳桿菌C88生長(zhǎng)最為合適的碳源,劉香英等[18]發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖與蔗糖的比例為1∶1時(shí),有利于植物乳桿菌K25的生長(zhǎng),但本實(shí)驗(yàn)中果糖、蔗糖等對(duì)植物乳桿菌ZU018的增殖并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì),麥芽糖更符合植物乳桿菌ZU018的生長(zhǎng)需要。初步確定麥芽糖作為植物乳桿菌ZU018的碳源。

圖1 不同碳源對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different carbon source on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.1.2 碳源濃度對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響 如圖2所示,隨著麥芽糖濃度的增加,植物乳桿菌ZU018的活菌數(shù)逐漸增加,當(dāng)濃度達(dá)到25 g/L時(shí),活菌數(shù)最大,達(dá)到5.74×109CFU/mL,麥芽糖的濃度增加到30 g/L,活菌數(shù)反而有所下降,這可能是因?yàn)檫^(guò)高的糖濃度會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境偏酸性化,從而抑制了植物乳桿菌ZU018的生長(zhǎng)[19]。選擇以25 g/L的麥芽糖為植物乳桿菌ZU018的碳源。

圖2 碳源濃度對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of concentration of carbon source on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018

2.1.1.3 不同氮源對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響 不同環(huán)境中的乳酸菌具有菌株和環(huán)境特異的氮代謝系統(tǒng),氮源的利用是制約乳酸菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[20]。不同種類的氮源經(jīng)過(guò)不同的水解工藝后,會(huì)產(chǎn)生不同組成的氨基酸、寡肽和多肽,此外,有機(jī)氮源往往還會(huì)含有少量的糖類、脂肪、無(wú)機(jī)鹽、維生素及某些生長(zhǎng)因子,更能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)[21]。本實(shí)驗(yàn)選取大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸粉為氮源,研究其對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響。

不同氮源的培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)的影響具有顯著性差異(P<0.05),如圖3A所示。酵母浸粉作為氮源,活菌數(shù)最高,此外,牛肉浸粉作為氮源也能獲得較高的活菌數(shù)。朱奇奇等[22]分析了5種有機(jī)氮源對(duì)植物乳桿菌I4菌體密度的影響,其結(jié)果也表明酵母浸粉最適宜該菌的增殖培養(yǎng)。

圖3 不同氮源對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on the growth of Lactobacillus Plantarum ZU018

與單獨(dú)使用有機(jī)氮源培養(yǎng)植物乳桿菌ZU018相比,多數(shù)使用有機(jī)混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組,活菌數(shù)有所增加,如圖3B所示,這與韓爽等[23]的研究結(jié)果相似。以牛肉浸粉和酵母浸粉作為混合氮源培養(yǎng)時(shí),活菌數(shù)最高,達(dá)到6.58×109CFU/mL,且高于僅以牛肉浸粉或酵母浸粉作為單一氮源。初步確定以復(fù)配比為1∶1 (m/m)的牛肉浸粉和酵母浸粉作為植物乳桿菌ZU018的氮源。

2.1.1.4 氮源濃度對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響 氮源濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的代謝均有著重要影響[24]。氮源含量過(guò)低,菌體生長(zhǎng)會(huì)因營(yíng)養(yǎng)不足受到影響;氮源含量過(guò)高,則會(huì)使微生物生長(zhǎng)過(guò)快,容易導(dǎo)致細(xì)胞老化和自溶[25]。合適的氮源濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)至關(guān)重要。如圖4A所示,隨著氮源總量的增加,活菌數(shù)也逐漸增加,復(fù)合氮源濃度為50 g/L時(shí),活菌數(shù)最高。

表4 部分因子實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression results of FFD

圖4 氮源濃度及復(fù)配比對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of concentration of nitrogen source and compounding ratio on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018

同時(shí),復(fù)合氮源的比例對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)也有一定的影響[26],以不同復(fù)配比例的復(fù)合氮源對(duì)植物乳桿菌ZU018進(jìn)行培養(yǎng),其結(jié)果如圖4B所示,當(dāng)?shù)磸?fù)配比例為1∶1時(shí),活菌數(shù)顯著(P<0.05)高于氮源復(fù)配比為1∶2或2∶1的實(shí)驗(yàn)組,達(dá)到8.31×109CFU/mL。有研究表明酵母浸粉成本高,不能在大規(guī)模發(fā)酵中使用,故而可增加其他氮源減少酵母浸粉的用量[27]。本實(shí)驗(yàn)以牛肉浸粉與酵母浸粉進(jìn)行復(fù)配,豐富蛋白營(yíng)養(yǎng)成分、可溶性強(qiáng),有利于植物乳桿菌的生長(zhǎng)代謝。選擇以50 g/L復(fù)配比為1∶1的牛肉浸粉和酵母浸粉作為植物乳桿菌ZU018的氮源。

2.1.2 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值,選擇單因素實(shí)驗(yàn)選出的碳源(麥芽糖)和氮源(牛肉浸粉和酵母浸粉)以及緩沖物質(zhì)(乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀)共6個(gè)因子作為篩選因素,每個(gè)因子分別確定高(+1)和低(-1)兩個(gè)水平,另設(shè)3個(gè)為零水平實(shí)驗(yàn)用于誤差估計(jì),共進(jìn)行19次試驗(yàn)以確定每個(gè)因子的影響水平,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Fractional factorial design and its experimental results

運(yùn)用Design Expert 10軟件,對(duì)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,并進(jìn)行方差檢驗(yàn),結(jié)果如表4所示,P值為0.0004,小于0.05,表明該擬合模型顯著。影響植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)的主次順序?yàn)?X3>X1>X5>X6>X4>X2,選取影響最為顯著的X1(麥芽糖)、X3(酵母浸粉)、X5(檸檬酸三銨)為后續(xù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的影響因子;此外,根據(jù)表4中回歸系數(shù)的大小和符號(hào),確定X1(麥芽糖)、X3(酵母浸粉)、X5(檸檬酸三銨)此三個(gè)顯著因素對(duì)應(yīng)的系數(shù)均為正,呈現(xiàn)為正效應(yīng)。

2.1.3 最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn) 由部分因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,牛肉浸粉和磷酸氫二鉀對(duì)植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)均無(wú)顯著影響,這些值保持不變,麥芽糖、酵母浸粉、檸檬酸三銨有顯著正效應(yīng),應(yīng)增加其濃度[28],最陡爬坡路徑設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示,處理4對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)(Y值)達(dá)到最大值10.12×109CFU/mL。將處理4選作后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Path and its experimental result of steepest ascent

2.1.4 Box-Behnken中心組合 根據(jù)部分因子實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,初步確定最適中心值為:麥芽糖31.00 g/L、酵母浸粉31.00 g/L、檸檬酸三銨3.20 g/L,取此三個(gè)因子為實(shí)驗(yàn)因素,以植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)(Y值)作為響應(yīng)值,進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn),設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and its experimental results of Box-Behnken

運(yùn)用Design Expert 10軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)作為響應(yīng)值,對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,建立回歸方程:

Lg(Y)=1.00-0.004458A+0.036B+0.022C+0.004337AB-0.002326AC+0.017BC-0.022A2-0.035B2-0.005352C2。

對(duì)上述回歸方程模型進(jìn)行方差分析如表7所示,結(jié)果表明,所選用的二次多項(xiàng)式模型高度顯著性(P<0.001),與實(shí)際情況擬合良好。其中實(shí)驗(yàn)因素B(酵母浸粉)、實(shí)驗(yàn)因素C(檸檬酸三銨)對(duì)植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)影響極顯著(P<0.001),而A(麥芽糖)對(duì)其的影響較小。同時(shí)三個(gè)因素之間的兩兩交互作用中,BC(即酵母浸粉與檸檬酸三銨)的交互作用對(duì)植物乳桿菌ZU018的活菌數(shù)影響極顯著。

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析表Table 7 ANOVA results of BBD

根據(jù)Design-Expert 10軟件得到的回歸分析結(jié)果如圖5所示,回歸模型存在最大值,一次項(xiàng)B、C極顯著,二次項(xiàng)A2、B2極顯著,交叉項(xiàng)BC極顯著;此外,麥芽糖和酵母浸粉、麥芽糖和檸檬酸三銨的交互作用較小,近似圓形:該回歸模型得出Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最優(yōu)結(jié)果為麥芽糖30.03 g/L、酵母浸粉37.50 g/L、檸檬酸三銨4.39 g/L,在此優(yōu)化條件下的活菌數(shù)為10.96×109CFU/mL。

圖5 麥芽糖、酵母浸粉和檸檬酸三銨交互作用對(duì)植物乳桿菌ZU018生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of effect of maltose,yeast extract and triammonium citrate interaction on growth of Lactobacillus plantarum ZU018

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性,按優(yōu)化的結(jié)果配制培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),設(shè)置平行組,3次試驗(yàn)結(jié)果的平均活菌數(shù)為10.67×109CFU/mL,和模型預(yù)測(cè)值接近,驗(yàn)證了此模型的準(zhǔn)確性。優(yōu)化后最終活菌數(shù)比優(yōu)化前的1.82×109CFU/mL提高4.86倍。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中碳源、氮源的研究,得到培養(yǎng)基的最佳碳源為麥芽糖,最佳氮源為復(fù)配比為1∶1的酵母浸粉和牛肉浸粉;通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)得到影響植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)的最主要因素為:麥芽糖、酵母浸粉、檸檬酸三銨;通過(guò)最陡爬坡路徑試驗(yàn)得到了響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平的中心點(diǎn):麥芽糖31.00 g/L、酵母浸粉31.00 g/L、檸檬酸三銨3.20 g/L;通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到最佳優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:麥芽糖30.03 g/L、酵母浸粉37.50 g/L、牛肉浸粉25.00 g/L、檸檬酸三銨4.39 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、乙酸鈉5.00 g/L、硫酸鎂 0.20 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、吐溫80 1.00 g/L。最終發(fā)酵液中植物乳桿菌ZU018活菌數(shù)相比優(yōu)化前提高4.86倍,達(dá)到10.67×109CFU/mL。本研究植物乳桿菌菌體濃度有顯著提高,為今后植物乳桿菌ZU018的擴(kuò)大培養(yǎng)和制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。