,*

(1.上海大學生命科學學院,上海 200444;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210)

甾體藥物被廣泛應用于維持生命、調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝、促進性器官發(fā)育、維持生殖等方面,已經(jīng)成為僅次于抗生素的第二大類藥物[1-2]。隨著甾體藥物市場需求的不斷提高,需要對其傳統(tǒng)合成路線進行不斷研究與創(chuàng)新,提高其合成效率和降低生產(chǎn)成本。利用微生物轉(zhuǎn)化降解甾醇得到重要甾體藥物中間體的研究,受到越來越多的關(guān)注[3]。9α-羥基雄烯二酮(9α-OH-AD)作為一種重要的甾體藥物中間體,通過對其活性部位進行結(jié)構(gòu)改造,可以得到氫化可的松、β米松、地塞米松、可的松等多種重要的甾體藥物,具有極高的商業(yè)價值[4-7]。

目前,制備9α-OH-AD的途徑主要有兩種:一種是兩步發(fā)酵法,首先由分枝桿菌對甾醇切除邊鏈生產(chǎn)雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD),然后借助其他微生物(例如諾卡氏菌、紅球菌屬或工程大腸桿菌)在AD的C9位引入羥基,得到9α-OH-AD,如王康等[8]將來源于分枝桿菌H37Rv 和紅平紅球菌SQ1的KSH基因在大腸桿菌中異源表達,具有將AD轉(zhuǎn)化得到9α-OH-AD的活性;另外一種方法則是通過對分枝桿菌進行篩選和改造,以甾醇為底物通過一步發(fā)酵直接得到9α-OH-AD,如楊亞力等[9]通過篩選得到一株偶發(fā)分枝桿菌,能夠代謝甾醇直接得到9α-OH-AD。兩步法需要先發(fā)酵純化得到AD,再以價格昂貴的AD為底物發(fā)酵得到9α-OH-AD,這種制備9α-OH-AD的途徑工藝復雜并且成本較高,而通過對分枝桿菌進行改造,以植物甾醇為底物直接得到9α-OH-AD,制備工藝簡單并且成本較低,是一種極具工業(yè)化潛力的路線。

3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH)是甾醇轉(zhuǎn)化過程中的一種關(guān)鍵酶[10-11],可以在AD的C9位上引入一個羥基,將AD轉(zhuǎn)化為9α-OH-AD[12]。KSH是一種由末端加氧酶(KshA)和鐵氧還蛋白還原酶(KshB)組成的多聚雙組分class IA型單加氧酶,KshA通常以三聚體形式行使功能,KshB通常以單體形式存在,這兩個組分需同時存在,KSH才具有活性[13-14]。除了上述兩個必需組分,KSH還需要還原態(tài)的輔基NADH作為電子供體[15]。袁家代等[16]在分枝桿菌中表達了KSH的編碼基因kshA和kshB,該菌能夠代謝甾醇產(chǎn)生9α-OH-AD,但是發(fā)酵液中9α-OH-AD的最大積累量僅為0.453 g/L。王貴娥等[17]在一株9α-OH-AD生產(chǎn)菌中通過強化KSH的活性,提高了9α-OH-AD的產(chǎn)量,但是最大產(chǎn)量僅為1.443 g/L。因此需要對分枝桿菌的甾醇代謝過程進行深入研究,構(gòu)建更加高效的產(chǎn)9α-OH-AD的工程菌株。

因此,為提高9α-OH-AD生產(chǎn)水平,本研究通過在一株產(chǎn)AD的分枝桿菌Mycobacteriumsp.TFZ中表達3-甾酮-9α-羥基化酶基因kshA1和kshB1,來構(gòu)建可以降解植物甾醇生產(chǎn)9α-OH-AD的工程菌株。進一步通過考察底物植物甾醇和不同表面活性劑吐溫的濃度對9α-OH-AD產(chǎn)量的影響,建立高效的油水兩相發(fā)酵體系,以期為實現(xiàn) 9α-OH-AD的進一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

分枝桿菌(MycobacteriumneoaurumDSM 44074,Mycobacteriumsp.TFZ)、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α均為本實驗室保藏;分枝桿菌過表達質(zhì)粒pMV306 本實驗室保存；Prime STAR HS高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ TaKaRa公司;ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒 南京諾唯贊生物技術(shù)公司;基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒 Axygen公司;雄烯二酮(AD)、9α-OH-AD標品 云南生物制品;植物甾醇 江蘇越紅飼料有限公司;玉米漿 上海源肽生物技術(shù)有限公司;酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、甘油 上海生工生物工程有限公司;卡那霉素、瓊脂、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80 上海麥克林生化科技有限公司;大豆油 中糧食品營銷有限公司;NaCl、K2HPO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、甲醇、乙酸乙酯等 均為分析純,國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

BSA 224S-CW型電子天平、PB-10型PH計 德國Sartorius;Centrifuge5430低溫離心機、Centrifuge5424型高速離心機 德國Eppendorf公司;DU730型紫外分光光度計 德國BecKman;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋;ZDP-A2160A型全自動電熱培養(yǎng)箱、ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LC-2010型高效液相色譜儀 日本島津公司;S1000TM型PCR儀 Thermal BIO-RAD;Molecular Imager? Gel DocTMXR System 生物技術(shù)公司;EPS 300電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,121 ℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基:向LB培養(yǎng)基中添加瓊脂15 g/L。分枝桿菌種子培養(yǎng)基:酵母粉15 g/L,葡萄糖6 g/L,NaNO35.4 g/L,(NH4)2HPO40.6 g/L,吐溫-80 2 g/L,pH7.5,115 ℃滅菌15 min。分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米漿23 g/L,K2HPO42 g/L,NaNO32.8 g/L,葡萄糖9 g/L[18],植物甾醇10 g/L,大豆油100 g/L,pH7.5,115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1的構(gòu)建 新金分枝桿菌M.neoaurumDSM 44074基因組DNA的提取,按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。根據(jù)基因kshA1和kshB1的堿基序列,分別設(shè)計引物P306-kshA1-F/R(atacatatgggatccgaattc GTGACTACCGA GACAGCCGG/gaagtgattcctccgaagctt TCAGCTCGGCTGAGCCGG)對kshA1基因進行擴增,設(shè)計引物P306-kshB1-F/R(gctcagccgagctgaaagctt GTGCTCGAACTGGAGATCGC/gaagtgattcctccgCTATTC GTCGTAGGTGACTTCCAC)對kshB1基因進行擴增。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ將pMV306質(zhì)粒線性化,然后利用in-fusion同源重組的方法將kshA1基因連接到質(zhì)粒pMV306的EcoRⅠ和HindⅢ位點之間構(gòu)建得到pMV306-kshA1質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ將pMV306-kshA1質(zhì)粒線性化,利用in-fusion同源重組的方法將kshB1基因連接到質(zhì)粒pMV306-kshA1的HindⅢ位點之后得到3-甾酮-9α-羥基化酶基因過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1。

1.2.3 分枝桿菌電轉(zhuǎn)和陽性克隆篩選 分枝桿菌Mycobacteriumsp.TFZ電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制作方法按照文獻[19]。將構(gòu)建好的3-甾酮-9α-羥基化酶基因過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1用電擊方法轉(zhuǎn)入Mycobacteriumsp.TFZ感受態(tài)細胞,并通過50 μg/mL的卡那霉素抗性平板進行抗性篩選,挑取單克隆。以出發(fā)菌株Mycobacteriumsp.TFZ為陰性對照,利用引物P306-kshA1-F/P306-kshB1-R進行菌落PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析正確的陽性菌落即為構(gòu)建的工程菌株。

1.2.4 重組菌株的生長曲線的繪制 將重組菌株劃線于固體LB培養(yǎng)基活化,30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后挑取單克隆接種于10 mL種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)后期(約48 h),得到液體種子,然后以10%體積的接種量接入50 mL種子培養(yǎng)基,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),每4 h取樣檢測菌液吸光度值OD600,以培養(yǎng)時間為橫坐標,OD600為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5 重組菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成分析 重組菌株液體種子培養(yǎng)方法同1.2.4,在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%體積的液體種子,于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至7 d,取樣進行HPLC檢測,分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的組成。

1.2.6 重組菌株對植物甾醇的轉(zhuǎn)化曲線 重組菌株液體種子培養(yǎng)過程詳見1.2.4,在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%體積的液體種子,放置在30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,每24 h取樣進行HPLC檢測AD和9α-OH-AD的濃度,以發(fā)酵時間為橫坐標,分別以AD和9α-OH-AD的濃度為縱坐標,得到重組菌株轉(zhuǎn)化植物甾醇過程中AD和9α-OH-AD的濃度變化曲線。

1.2.7 發(fā)酵體系的優(yōu)化

1.2.7.1 不同濃度植物甾醇對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基其他組分不變,植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L,每個條件設(shè)置三組平行實驗,發(fā)酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.2 不同種類吐溫對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基其他組分不變,植物甾醇投料量為20 g/L,吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80的濃度均為4 g/L[20],每個條件設(shè)置三組平行實驗,發(fā)酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.3 不同濃度吐溫-80對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基其他組分不變,植物甾醇投料量為20 g/L,吐溫-80的濃度分別為1、2、4、6、8、10 g/L,每個條件設(shè)置三組平行實驗,發(fā)酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.4 不同濃度植物甾醇條件下吐溫-80對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基其他組分不變,植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L,對照組不加吐溫-80,實驗組添加2 g/L的吐溫-80,每個條件設(shè)置三組平行實驗,發(fā)酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.8 AD和9α-OH-AD的檢測分析

1.2.8.1 樣品處理 在分枝桿菌進行甾醇發(fā)酵過程中取樣,用等量的乙酸乙酯對樣品反復萃取三次,將三次萃取液混合在一起,取50 μL萃取液蒸干,用適量的甲醇超聲溶解,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行液相色譜檢測。

1.2.8.2 檢測方法 AD和9α-OH-AD具有共軛結(jié)構(gòu),在254 nm處有吸收峰,所以采用高效液相色譜的方法在254 nm下的吸收值,通過比對標準品建立的標準曲線,可以測定產(chǎn)物的相對含量[21]。

AD和9α-OH-AD標準曲線的繪制方法為: 分別準確稱量AD和9α-OH-AD標品各0.0500 g,用甲醇將二者溶解并定容至50 mL,配成1 g/L的標準品母液,檢測時用甲醇將其準確稀釋到濃度分別為0.100、0.080、0.060、0.040、0.020、0.010、0.005、0.001 g/L,HPLC測定其在254 nm下的吸收峰的峰面積,分別以AD和9α-OH-AD標品濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標,可以分別得到AD和9α-OH-AD的標準曲線方程。

色譜分析條件:C18反相層析柱(Agilent Extend-C18 column,4.6×250 mm,5 μm);流動相為80%甲醇:20%水(V/V),流速為0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣體積為20 μL;紫外檢測波長為254 nm。

1.2.8.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成成分測定 出發(fā)菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株TFZ3215的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測,產(chǎn)物中的AD、9α-OH-AD、22-羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(4-BNA)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睪酮(T)和9α,22-二羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(9-OH-BNA)在254 nm處均有吸收峰,通過與標準品的出峰時間相比較,由此得出各組分對應的出峰時間和峰面積[22]。根據(jù)HPLC歸一化法[23-24],將所有組分的出峰面積總和看作100%,由各組分的峰面積占總峰面積的比例,得到各個組分在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理做三次平行,采用Origin Pro 9.1軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。單因素實驗結(jié)果采用SPSS StatisticsV17.0進行顯著性分析,標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05),標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達質(zhì)粒的構(gòu)建和重組菌株的篩選

過表達質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖1所示,以新金分枝桿菌M.neoaurumDSM 44074基因組DNA為模板,分別用引物P306-kshA1-F/R和P306-kshB1-F/R進行PCR擴增,得到目的片段kshA1(大小為1188 bp)和kshB1(大小為1029 bp),如圖2泳道1、2所示。pMV306質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切線性化的片段(大小為4358 bp)如泳道3所示,pMV306-kshA1質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ單酶切線性化的片段(大小為5546 bp)為pMV306質(zhì)粒和目的片段kshA1長度之和(泳道4)。pMV306-kshA1-kshB1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗證的結(jié)果如泳道5,短條帶為目的片段kshA1,長條帶為pMV306質(zhì)粒和目的片段kshB1長度之和。將pMV306-kshA1-kshB1質(zhì)粒送上海杰李測序公司,以P306-kshA1-F/P306-kshB1-R引物進行測序。

圖1 過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1的構(gòu)建策略Fig.1 Construction schematic of over-expression plasmid pMV306-kshA1-kshB1

圖2 過表達質(zhì)粒的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of over-expression plasmid注:M:DNA Marker;1:目的基因kshA1條帶;2:目的基因kshB1條帶;3:pMV306質(zhì)粒EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切條帶;4:pMV306-kshA1質(zhì)粒HindⅢ單酶切條帶;5:pMV306-kshA1-kshB1質(zhì)粒酶切驗證條帶;6:出發(fā)菌株TFZ對照;7:重組菌TFZ3215菌落PCR驗證。

挑取陽性單克隆,以引物P306-kshA1-F/P306-kshB1-R進行菌落PCR驗證,結(jié)果如泳道7所示,該片段在2200 bp左右,為kshA1和kshB1片段長度之和,經(jīng)測序該片段為基因kshA1和kshB1,并且出發(fā)菌株TFZ菌落PCR結(jié)果如泳道6所示無目的條帶。由此可知,過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1已轉(zhuǎn)入Mycobacteriumsp.TFZ菌株,得到重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215。

2.2 重組菌株的生長狀況

出發(fā)菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215的生長狀況如圖3所示,出發(fā)菌株和重組菌株的生長狀況大致相同,0～9 h為滯后期,10～25 h為對數(shù)生長期,25～35 h為平穩(wěn)期,之后進入衰退期。說明過表達質(zhì)粒pMV306-kshA1-kshB1的轉(zhuǎn)入不會對重組菌TFZ3215的生長產(chǎn)生負面影響。

圖3 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215生長曲線Fig.3 Growth curve of Mycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.3 AD和9α-OH-AD的標準曲線方程

將8種不同濃度的AD和9α-OH-AD標品分別經(jīng)HPLC檢測后,根據(jù)它們的峰面積,分別計算AD和9α-OH-AD的標準曲線方程。

9α-OH-AD標準曲線的回歸方程為:

Y=112.951X-0.006

式中:X表示9α-OH-AD的濃度,g/L;Y表示相應的峰面積,106;9α-OH-AD的濃度在0.001～0.08 g/L范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r=0.99963,顯示了極好的線性關(guān)系。

AD標準曲線的回歸方程為:

Y=110.851X-0.007

式中:X表示AD的濃度,g/L;Y表示相應的峰面積,106;AD的濃度在0.001～0.08 g/L范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r=0.99961,顯示了極好的線性關(guān)系。

2.4 出發(fā)菌株和重組菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

分別利用出發(fā)菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215對植物甾醇進行生物轉(zhuǎn)化,用高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。出發(fā)菌株TFZ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的主要產(chǎn)物為AD,含量為80.1%,還有大量(約12%)的22-羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(4-BNA)和少量的雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睪酮(T)和9α-OH-AD等副產(chǎn)物。重組菌株TFZ3215的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中,9α-OH-AD是主要產(chǎn)物,含量達到了94.7%,僅有少量的AD和9α,22-二羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(9-OH-BNA)雜質(zhì),而4-BNA、ADD和T等雜質(zhì)已消失。重組菌株TFZ3215與出發(fā)菌株TFZ相比,主產(chǎn)物由AD轉(zhuǎn)化為9-OH-AD,主要產(chǎn)物的純度由80.1%增加至94.7%,雜質(zhì)的量也明顯減少,具有重要的工業(yè)化應用前景。

表1 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析Table 1 Analysis of the products of the Mycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.5 重組菌株對植物甾醇的轉(zhuǎn)化

出發(fā)菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215以植物甾醇為底物進行生物轉(zhuǎn)化,發(fā)酵液中AD和9α-OH-AD濃度的變化情況如圖4所示。出發(fā)菌株TFZ和重組菌株TFZ3215發(fā)酵過程中AD濃度的變化情況如圖4A所示,出發(fā)菌株TFZ發(fā)酵過程中AD的濃度逐漸增加,達到約3.28 g/L,而重組菌株TFZ3215發(fā)酵液中AD的積累量僅約0.12 g/L。出發(fā)菌株TFZ和重組菌株TFZ3215發(fā)酵過程中9α-OH-AD濃度的變化情況如圖4B所示,出發(fā)菌株TFZ發(fā)酵過程中僅有極少量的9α-OH-AD積累,約0.07 g/L,重組菌株TFZ3215發(fā)酵液中9α-OH-AD濃度隨著時間推移不斷增加,最終積累量達到3.43 g/L左右,9α-OH-AD的濃度是出發(fā)菌株的49倍。上述實驗結(jié)果表明:重組菌株中轉(zhuǎn)入的kshA1和kshB1基因已經(jīng)成功表達,且3-甾酮-9α-羥基化酶具有極好的催化活性,可以將AD高效的轉(zhuǎn)化為9α-OH-AD。

圖4 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215對植物甾醇的生物轉(zhuǎn)化Fig.4 Bioconversion of phytosterols byMycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.6 重組菌株發(fā)酵體系的優(yōu)化

2.6.1 植物甾醇的濃度對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 為了提高重組菌TFZ3215的9α-OH-AD產(chǎn)量,增加發(fā)酵底物植物甾醇的投料量,測定發(fā)酵液中9α-OH-AD的積累量。如圖5所示,當植物甾醇的投料量為15 g/L時,9α-OH-AD產(chǎn)量增加至5.22 g/L,是植物甾醇投料量為10 g/L時的1.5倍。植物甾醇增加至20 g/L及以上時,9α-OH-AD產(chǎn)量反而低于植物甾醇投料量為10 g/L時,這可能是由于過高濃度的植物甾醇影響了反應體系的乳化,難以形成均勻穩(wěn)定的反應體系,影響了植物甾醇的轉(zhuǎn)化,進而導致9α-OH-AD產(chǎn)量的減少。為了使油水體系均一穩(wěn)定,可以通過添加分散劑的方法來達到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化狀態(tài)[25]。

圖5 不同濃度植物甾醇條件下9α-OH-AD產(chǎn)量Fig.5 Yield of 9α-OH-AD under different concentrations of phytosterols注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；圖6～圖7同。

2.6.2 不同種類吐溫對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 吐溫作為一種非離子型表面活性劑,能促進不溶于水的植物甾醇在水相中的分散,在油水轉(zhuǎn)化體系中,可以促進反應體系的乳化,從而達到均勻的狀態(tài),促進植物甾醇的轉(zhuǎn)化。在植物甾醇的投料量為20 g/L的基礎(chǔ)上,添加4 g/L不同的吐溫作為表面活性劑,168 h后取樣測定9α-OH-AD產(chǎn)量。結(jié)果表明,添加吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60作為表面活性劑的實驗組中,9α-OH-AD產(chǎn)量顯著低于對照組(P<0.05),而在添加吐溫-80作為表面活性劑時,9α-OH-AD產(chǎn)量為5.24 g/L,9α-OH-AD的產(chǎn)量是對照組(2.18 g/L)的2.4倍(圖6),顯著高于對照組(P<0.05)。這說明吐溫的種類及乳化能力會影響甾醇轉(zhuǎn)化的效率,吐溫-80乳化能力比其他3種吐溫更強,主要原因可能是吐溫-80可以使菌體、油脂和植物甾醇更容易形成均勻狀態(tài),從而有利于植物甾醇的轉(zhuǎn)化。

圖6 不同種類吐溫條件下9α-OH-AD產(chǎn)量Fig.6 9α-OH-AD yield under different types of Tween

2.6.3 不同濃度吐溫-80對產(chǎn)9α-OH-AD的影響 反應體系中吐溫-80的濃度過低,油水體系不能很好地乳化,不利于植物甾醇的轉(zhuǎn)化,而吐溫-80的濃度過高,會抑制菌體的生長,同樣影響植物甾醇的轉(zhuǎn)化,因此需要優(yōu)化體系中吐溫-80的質(zhì)量濃度。在植物甾醇的投料量為20 g/L的基礎(chǔ)上,通過在發(fā)酵液中添加不同質(zhì)量濃度的吐溫-80來分析不同吐溫-80含量對9α-OH-AD產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明:吐溫-80的質(zhì)量濃度對9α-OH-AD產(chǎn)量有著顯著影響(P<0.05),當吐溫-80的質(zhì)量濃度增加至2 g/L時,9α-OH-AD的產(chǎn)量逐漸增加至7.12 g/L,是對照組的3.3倍,當吐溫-80的質(zhì)量濃度超過2 g/L后,9α-OH-AD的產(chǎn)量逐漸減少(圖7)。上述研究結(jié)果表明:當發(fā)酵液中吐溫-80的質(zhì)量濃度為2 g/L時,能夠有效地促進反應體系的乳化,促進分枝桿菌對底物植物甾醇的轉(zhuǎn)化,提高了產(chǎn)物9α-OH-AD的產(chǎn)量。

圖7 不同濃度吐溫-80條件下9α-OH-AD產(chǎn)量Fig.7 Production of 9α-OH-AD at different concentrations of Tween-80

2.6.4 不同濃度植物甾醇條件下吐溫-80對9α-OH-AD產(chǎn)量的影響 在植物甾醇投料量為20 g/L時,2 g/L的吐溫-80可以顯著提高9α-OH-AD的產(chǎn)量。為了驗證在不同投料量的條件下,優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系仍然有效,在添加2 g/L的吐溫-80的條件下,考察了植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L時,發(fā)酵液中9α-OH-AD的產(chǎn)量。研究結(jié)果表明:當植物甾醇的投料量為10、15 g/L時,與對照(無吐溫-80)相比,9α-OH-AD的產(chǎn)量增加較少,可能是因為植物甾醇的投料量較低,油水體系能夠達到均勻穩(wěn)定的狀態(tài),吐溫-80不是影響甾醇轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。當植物甾醇為25 g/L時,9α-OH-AD的產(chǎn)量為7.53 g/L,為優(yōu)化前的4.4倍;而當植物甾醇的投料量為30 g/L時,9α-OH-AD的產(chǎn)量為5.6 g/L,是優(yōu)化前的3.3倍,但是低于植物甾醇為25 g/L時的產(chǎn)量,這可能是由于植物甾醇的投料量過高,難以形成均一穩(wěn)定的乳化體系,導致底物植物甾醇轉(zhuǎn)化率過低,從而減少了產(chǎn)物9α-OH-AD的產(chǎn)量。

圖8 2 g/L吐溫-80和不同濃度植物甾醇條件下9α-OH-AD產(chǎn)量Fig.8 Yield of 9α-OH-AD under 2 g/L of Tween-80 and different concentrations of phytosterols

3 結(jié)論與討論

本實驗在一株主產(chǎn)AD的Mycobacteriumsp.TFZ中成功表達了KSH酶,得到一株可直接轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-OH-AD的工程菌Mycobacteriumsp.TFZ3215,與出發(fā)菌株相比,9α-OH-AD的含量由1.7%提高到94.7%,AD的含量由80.1%減少到3.4%。在油-水雙相的發(fā)酵體系中,底物植物甾醇濃度為10 g/L時,重組菌Mycobacteriumsp.TFZ3215的9α-OH-AD產(chǎn)量為3.43 g/L。進一步對乳化體系進行優(yōu)化,結(jié)果表明:在發(fā)酵液中添加2 g/L的吐溫-80,9α-OH-AD產(chǎn)量可提高到7.53 g/L,為優(yōu)化前的4.4倍,顯著高于國內(nèi)報道的水平[26-28]。但是構(gòu)建的工程菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215在轉(zhuǎn)化植物甾醇的過程中,出現(xiàn)了副產(chǎn)物9-OH-BNA,推測該副產(chǎn)物來自于側(cè)鏈的不完全降解[22],因此,后續(xù)需要對工程菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215進一步改造,從而減少副產(chǎn)物9-OH-BNA的生成。另外,在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)當植物甾醇的投料量增加至30 g/L時,9α-OH-AD產(chǎn)量卻低于25 g/L的植物甾醇投料量,這可能是由于植物甾醇的投料量的增加重新破壞了發(fā)酵液中的乳化體系,影響了植物甾醇的轉(zhuǎn)化。因此,應進一步優(yōu)化發(fā)酵體系中植物油和植物甾醇的比例關(guān)系或篩選更加高效的乳化劑,使油水轉(zhuǎn)化體系達到更加穩(wěn)定均一的狀態(tài),提高植物甾醇的轉(zhuǎn)化率,從而進一步提高9α-OH-AD產(chǎn)量。