譚富耀,盛趙越,胡 婷,王蔚新,占劍峰,李士明,吳 鵬

(黃岡師范學院生物與農(nóng)業(yè)資源學院,經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北黃岡 438000)

福白菊是產(chǎn)于以福田河鎮(zhèn)為中心的湖北省麻城市北部山區(qū)的白菊花,因以麻城市福田河鎮(zhèn)為主產(chǎn)區(qū)而稱之為麻城福白菊,其朵大肥厚、味甘醇美、氣清香,具有養(yǎng)肝明目、解毒消腫、散風清熱等功效[1],是最適宜人類飲用的保健類菊花。福白菊雖不如杭白菊和貢菊那樣為人熟知,卻有不同于其他品種菊花的種質(zhì)資源和優(yōu)良品質(zhì),富含黃酮和綠原酸,是藥食兼用型中藥材[2-3]。

黃酮類化合物又稱生物類黃酮,具有抗菌、消炎、降低血壓、抗腫瘤、降壓及調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效[4-5],在多個領域具有廣泛的應用前景。麻城福白菊中總黃酮含量為6.17%～8.19%,遠高于藥典標準。目前,對菊花總黃酮提取方法的研究已有一些報道,比如水提法、微波輔助提取法、酶解法及回流法等。宋德海等[6]采用回流法對野菊花總黃酮的提取進行了研究,陳婷[7]通過正交試驗優(yōu)化菊花總黃酮的提取條件,崔建強等[8]利用響應面法優(yōu)化了野菊花中總黃酮的微波輔助提取工藝,李金鳳等[9]利用亞臨界水提取法提取懷菊花中總黃酮并研究其抗氧化性。超聲波提取黃酮是利用超聲波不斷震蕩提取液,破壞細胞和細胞膜結(jié)構(gòu),增強細胞內(nèi)物質(zhì)通過細胞膜的透過率,有利于提取物的釋放[10],相比其他提取方法,超聲波輔助提取具有省時、高效、雜質(zhì)少的優(yōu)點。但響應面法優(yōu)化麻城福白菊中總黃酮超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性研究未見文獻報道。

因此,為了有效的開發(fā)及利用福白菊資源,充分提取其所含的總黃酮成分,實驗以麻城福白菊為原材料,利用有機溶劑與超聲波結(jié)合的方法,提取福白菊中總黃酮,運用單因素及響應面試驗設計優(yōu)化提取工藝,得到最優(yōu)參數(shù)組合,并通過測定福白菊中總黃酮清除DPPH自由基的能力和總還原能力評價其抗氧化活性,旨在為麻城福白菊總黃酮的深加工提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麻城福白菊 湖北新奇益科技有限公司;無水乙醇(分析純) 天津市天力化學試劑有限公司;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基 上海麥克林生化科技有限公司;氯化鐵 酷爾化學科技(北京)有限公司;亞硝酸鈉(分析純)、氫氧化鈉(粒狀，分析純)、硝酸鋁、九水(分析純)、鐵氰化鉀(分析純)、L(+)-抗壞血酸(分析純)、三氯乙酸(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;標準檢驗篩 浙江上虞市五四紗篩廠制造;KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;高速萬能粉碎機、DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;H/T18MM臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 福白菊黃酮提取工藝流程 福白菊→粉碎→過篩→稱重→超聲波浸提→抽提過濾→定容→稀釋→福白菊黃酮提取液[11]

福白菊的預處理:將福白菊烘干(60 ℃,1 h),粉碎后過80 目篩,再將其粉末烘干、密封備用。

超聲波浸提:精確稱取1 g福白菊粉放入錐形瓶中,根據(jù)料液比1∶25 g/mL加入70%乙醇作為提取劑,按照設定溫度和超聲波功率處理一定時間后,趁熱減壓抽濾,將濾液用70%乙醇定容至100 mL,得黃酮樣品原液。

1.2.2 單因素實驗 分別對超聲功率、超聲時間和超聲溫度進行單因素實驗,確定各因素的適宜取值范圍,從而選擇響應面的設計試驗的因素水平范圍[12]。

1.2.2.1 超聲波功率 取1 g福白菊粉,在提取料液比為1∶25 g/mL、超聲時間為20 min、超聲溫度為60 ℃的條件下,分別探討超聲波功率為300、350、400、450、500 W對黃酮類化合物得率的影響。

1.2.2.2 超聲時間 取1 g福白菊粉,在提取料液比為1∶25 g/mL,超聲波功率為200 W,超聲溫度為60 ℃條件下分別探索超聲時間為30、40、50、60、70 min對黃酮類化合物得率的影響。

1.2.2.3 超聲溫度 取1 g福白菊粉,在提取料液比為1∶25 g/mL,超聲時間為20 min,超聲波功率為200 W條件下探討超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃對黃酮類化合物得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 以單因素實驗為基礎,以超聲時間(A)、超聲波功率(B)、超聲溫度(C)為獨立自變量,福白菊黃酮得率(Y)為響應值,利用Box-Behnken中心設計方法進行3因素3水平響應面試驗設計[13],因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平設計Table 1 Factors and levels in response test

1.2.4 黃酮得率的計算

1.2.4.1 最大吸收波長的選擇 菊花中含有多種黃酮類化合物,其黃酮母核中含有的游離羥基,在適當?shù)慕橘|(zhì)條件下能與金屬鋁離子形成絡合物而顯色,顯色后于510 nm波長處有最大吸收峰值[14]。鑒于蘆丁和黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)均以2-苯基色原酮為母核,吸光測試性質(zhì)相似,故以蘆丁作為測定福白菊黃酮含量的參比物,選取510 nm為測定波長,測定其吸光度并繪制標準曲線。

1.2.4.2 蘆丁標準曲線的繪制 參考宋琳琳等[15]方法,精確稱取0.0150 g蘆丁參照物放置在50 mL容量瓶中。用體積分數(shù)為70%乙醇定容、搖勻后得到標準溶液。分別量取參照物溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻后靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻后靜置6 min,加入4 mL體積分數(shù)為4%氫氧化鈉溶液后再用30%乙醇定容,搖勻放置15 min,在510 nm處測定吸光度[16]。以吸光度A為縱坐標,蘆丁濃度C為橫坐標,繪制得回歸方程曲線y=0.1547x+0.0059,決定系數(shù)R2為0.9992。

1.2.4.3 福白菊總黃酮得率計算 取1.5 mL黃酮樣品原液,按標準曲線繪制方法制備待測樣品溶液。在波長為510 nm處測定吸光度,計算福白菊中黃酮的得率。將測定所得的吸光值代入回歸方程中計算黃酮質(zhì)量濃度,再計算出黃酮的得率[17]。

式中:ω表示福白菊中總黃酮的得率,%;V表示提取液體積,mL;c表示由回歸方程計算出的樣液中總黃酮濃度,g·L-1;N表示稀釋倍數(shù);W表示菊花粉末質(zhì)量,g;1000表示單位換算系數(shù)。

1.2.5 福白菊黃酮抗氧化活性探究

1.2.5.1 總還原能力 以抗壞血酸為對照,將黃酮提取液分別配制成濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L的待測樣液。用蒸餾水做參比,先分別加入1 mL樣液,再加入2.5 mL磷酸鹽溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀,放置于50 ℃水浴中反應20 min后加入10%三氯乙酸2.5 mL,3000 r/min離心10 min后取上清液2 mL放入另一管中,隨后加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混勻后室溫反應10 min,在700 nm處測定吸光值,吸光度值越大,則證明總還原能力越強[18]。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率 以抗壞血酸為對照,將黃酮提取液分別配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的待測樣液。將2 mL黃酮提取液與2 mL質(zhì)量濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液混勻置于試管中,室溫下在暗處靜置30 min后,以無水乙醇作為參比,在517 nm處測定其吸光度Ax;同時以2 mL無水乙醇代替樣品,與2 mL DPPH溶液混勻后在同一吸收波長處測定其吸光值A0;再取等濃度的樣品與等體積無水乙醇混合,測定其本底吸光值AX0,并計算得DPPH自由基的清除率[19]。

式中:A0:2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇的混合溶液吸光度;AX:2 mL黃酮樣品溶液與2 mL DPPH溶液的混合溶液吸光度;AX0:2 mL黃酮樣品與2 mL無水乙醇等體積混合液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行重復測定3次,利用Design Expert 8.0軟件進行響應面試驗設計和結(jié)果分析,采用Microsof Excel 2010及SPSS 25.0對單因素及抗氧化研究數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對得率的影響 由圖1可得知,當超聲波功率為300～400 W時,黃酮的得率逐漸升高,功率為400 W時,黃酮的得率最大,為6.31%;而超聲波功率為400～500 W時,黃酮的得率又逐漸下降,可能是超聲波能在物料內(nèi)部產(chǎn)生振動,超聲波功率較小對植物細胞和分子間的作用較小,超聲波功率增大,空化效應更強烈,因此黃酮得率增大;但功率過大時致使黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞,從而得率下降[20]。

圖1 超聲波功率對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield of flavonoids注:不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05);圖2～圖3同。

2.1.2 超聲時間對得率的影響 如圖2所示,在30～60 min內(nèi),黃酮類化合物的得率隨超聲時間的延長而增多。當超聲時間在30～40 min之間時,得率相對穩(wěn)定。當超聲時間為40～60 min時,福白菊黃酮的得率顯著提高。當超聲時間為60 min時,黃酮得率達到最大,為6.36%,而當超聲時間大于60 min時,得率開始迅速下降。說明在60 min左右時,福白菊粉末與乙醇充分接觸,黃酮溶出充分,繼續(xù)增加超聲波處理時間,會導致黃酮分子結(jié)構(gòu)被破壞,從而黃酮得率降低[21]。

圖2 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids

2.1.3 超聲溫度對得率的影響 由圖3可得知,超聲溫度的變化對黃酮得率影響效果明顯,超聲溫度在30～60 ℃時,得率由5.18%增加至5.96%,在此階段黃酮得率有顯著的上升趨勢。超聲溫度為60 ℃時,黃酮得率達最高,為5.96%。但當溫度為70 ℃時,黃酮的得率又快速下降至5.18%。原因是溫度過高,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)遭受到破壞[22],導致其有效活性成分和原料流失,同時雜質(zhì)溶解度和溶劑損失成分增加。

圖3 超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of flavonoids

2.2 超聲波輔提福白菊黃酮工藝響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果 以單因素實驗選擇的水平范圍為基礎,超聲時間(A)、超聲波功率(B)和超聲溫度(C)為影響因子,福白菊黃酮得率(Y)為響應值,采用Box-Behnken實驗設計針對黃酮得率和三個因素進行響應面設計得到17組試驗點[23]。實驗設計和結(jié)果分析見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果分析Table 2 Design and analysis results of response surface experiments

Y=6.85-0.099A+0.58B+0.050C-0.24AB-0.17AC-0.27BC-0.12A2-0.51B2-0.25C2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0軟件對響應面試驗進行設計和結(jié)果分析(表2),并進行二次多元回歸擬合,得回歸方程模型[24-25]:

2.2.2 響應面分析 基于回歸模型分析,通過各因素的相互作用,對福白菊黃酮得率進行響應面和等高線圖分析[27],建立三維模型圖。見圖4～圖6。

從圖4、圖5和圖6可以直觀地看出三個因素的交互作用對福白菊黃酮得率的相關影響,隨著超聲溫度、超聲時間以及超聲波功率的梯度增加,黃酮得率呈先升高后下降的變化,因此在選用的數(shù)值范圍間存在極值。響應曲面坡度越陡峭,說明響應值變化對相關因素的交互作用越敏感,反之則交互作用對響應值影響越小。圖4和圖6中響應面圖坡度陡峭,表明其相關影響因子對黃酮得率的交互作用顯著。而圖5中的響應面曲線弧度較平滑,說明超聲溫度和超聲時間的交互作用對黃酮得率的影響較小。由模型圖的總體分析可以看出,隨超聲波功率的逐漸增加,黃酮得率變化更敏感,證明提取功率對黃酮得率的作用影響均大于超聲時間和超聲溫度,這與方差分析結(jié)果吻合,證明響應面試驗優(yōu)化結(jié)果的合理可靠[28]。

圖4 超聲波功率與超聲時間交互作用對福白菊黃酮得率的影響Fig.4 Effect of interaction between ultrasonic power and time on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

圖5 超聲溫度與超聲時間交互作用對福白菊黃酮得率的影響Fig.5 Effect of interaction between ultrasonic temperature and time on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

圖6 超聲溫度與超聲波功率交互作用對福白菊黃酮得率的影響Fig.6 Effect of interaction between ultrasonic temperature and power on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

2.2.3 試驗結(jié)果驗證 利用軟件Design Expert 8.0響應面模型進行分析,根據(jù)模型分析預測出福白菊黃酮的最大得率為7.16%,此時其最優(yōu)工藝組為:超聲時間50.00 min,超聲波功率439.9 W,超聲溫度60.08 ℃。根據(jù)實際條件將最優(yōu)工藝調(diào)整為:超聲時間50 min,超聲波功率440 W,超聲溫度60 ℃。按照此條件組做三次平行試驗,實際測得平均黃酮得率為7.15%,與響應面設計分析的預測值基本吻合,相對誤差為0.01%,證明該模型預測結(jié)果有效可靠。

2.3 福白菊黃酮抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 總還原能力測定結(jié)果 福白菊黃酮及抗壞血酸的總還原能力測定結(jié)果見圖7。

圖7 福白菊黃酮的總還原能力Fig.7 Total antioxidant capacity of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium注:不同小寫字母代表相同質(zhì)量濃度差異顯著,P<0.05;圖8同。

由圖7可知,福白菊總黃酮總還原能力與其質(zhì)量濃度間呈正相關關系,當黃酮質(zhì)量濃度在0.01～0.05 g/L的范圍內(nèi),黃酮的總還原能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增大。當福白菊黃酮質(zhì)量濃度為0.05 g/L時,其總還原能力最高,即吸光度值最大,為0.341。與相同濃度的抗壞血酸相比,福白菊黃酮的總還原能力略低于抗壞血酸。

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果 福白菊黃酮及抗壞血酸清除DPPH自由基能力測定結(jié)果見圖8。

圖8 福白菊黃酮DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

由圖8可知,不同質(zhì)量濃度的黃酮樣品溶液的DPPH自由基清除能力不同,當黃酮溶液濃度在0.1～0.5 g/L范圍內(nèi)時,隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大,其溶液對DPPH自由基的清除能力也逐步增加,但均小于90%。當黃酮溶液濃度為0.5 g/L時清除率為81.25%,達到最高。福白菊黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.191 g/L,抗壞血酸在0.1～0.5 g/L的濃度區(qū)間，其對DPPH自由基的清除能力遠大于50%,說明在相同濃度下,黃酮溶液對DPPH自由基的清除能力弱于抗壞血酸。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取福白菊中的黃酮類化合物,并對其抗氧化活性進行探討。在單因素試驗的基礎上,通過響應面試驗設計得出最佳工藝參數(shù)組合為:超聲波功率為440 W,超聲溫度為60 ℃,超聲時間為50 min,黃酮得率為7.15%?？寡趸钚匝芯勘砻?當黃酮溶液濃度為0.05 g/L時,總還原能力最強,此時測得的吸光度值最大,為0.341;當黃酮溶液濃度為0.5 g/L時,其對DPPH自由基的清除率達到81.25%,對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.191 g/L,表明福白菊黃酮提取液具有較好的抗氧化活性,可以為福白菊黃酮類化合物的探索研究及進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù),也可提高麻城福白菊開發(fā)價值和經(jīng)濟效益。