,2,*,2

(1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,江蘇南京 210019;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

隨著國(guó)民生活水平的提高、人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,超重和肥胖的發(fā)病率逐日上升。由肥胖導(dǎo)致的糖尿病、睡眠呼吸暫停綜合癥、脂肪肝、抑郁癥、心腦血管疾病等臨床現(xiàn)象愈發(fā)普遍[1]。目前WHO認(rèn)為肥胖是威脅人類健康的十大疾病之一[2]。一些非法商家利用部分患者減肥心切和諱疾忌醫(yī)的心理,在減肥類保健食品中非法添加某些化學(xué)藥品以達(dá)迅速療效。目前市面上減肥類保健食品中常見(jiàn)的非法添加物有多類[3]:食欲抑制劑(西布曲明、芬氟拉明)、能量消耗劑(麻黃堿、咖啡因)、利尿劑(呋塞米、氫氯噻嗪)、抗抑郁劑(氟西汀、安非他酮)等化學(xué)藥物,長(zhǎng)期服用可能會(huì)產(chǎn)生藥物依賴性,甚至損害器官、危害健康[4]。

目前大量文獻(xiàn)報(bào)道了檢測(cè)保健食品中非法添加的違禁化學(xué)藥物的儀器檢測(cè)方法,包括毛細(xì)管電泳法[5]、薄層色譜與拉曼光譜法[6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]等。這些檢測(cè)方法專屬性和準(zhǔn)確性較高,但存在前處理操作繁瑣,對(duì)環(huán)境、設(shè)備、操作人員要求較高等問(wèn)題,均不適用于保健食品非法添加的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查,造成監(jiān)督檢驗(yàn)的時(shí)效性不高、支撐力不夠的局面[10]。

離子遷移譜(IMS)是上世紀(jì)70年代初發(fā)展起來(lái)的一種微量化學(xué)物質(zhì)分析檢測(cè)技術(shù),它是基于氣相中不同的氣相離子在電場(chǎng)中遷移速度的差異來(lái)對(duì)化學(xué)離子物質(zhì)進(jìn)行表征,作為快捷便利的分析手段,IMS具有小型化、易攜帶、操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)[13-14],在痕量檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)極為突出,分析時(shí)間為S級(jí)。隨著快檢車的出現(xiàn),可以作為車載儀器手段加以推廣。目前,IMS已在毒品[15]、爆炸物[16]、藥品濫用[17]等方面得到廣泛應(yīng)用。它可作為快篩方法用于市場(chǎng)監(jiān)督,已有文獻(xiàn)報(bào)道可應(yīng)用于壯陽(yáng)類保健食品中非法添加的5型磷酸二酯酶抑制劑[18];改善睡眠類保健品中非法添加的巴比妥類藥物[19];抗風(fēng)濕類中成藥中添加的非甾體抗炎藥[20]等。

IMS有固、液、氣多種進(jìn)樣方式,何歡等[21]以63Ni作為電離源,用溶液點(diǎn)于試紙直接進(jìn)樣的方式對(duì)減肥類保健食品進(jìn)行了非法添加的篩查。本文利用電噴霧-離子遷移譜(ESI-IMS)法,對(duì)減肥類保健食品中常見(jiàn)的22種非法添加藥物進(jìn)行分析,建立了減肥類保健食品中非法添加的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查方法,并對(duì)40批減肥類保健食品樣品進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

40批保健食品標(biāo)示具有減肥類功效 均為市售;甲醇 HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司;乙酸 HPLC級(jí),美國(guó)Sigma Aldrich公司;氨水 HPLC級(jí),Aladdin公司;色氨酸(純度99.9%)、檸檬酸(純度97.0%)、普羅布考(純度100.0%)、鹽酸芬氟拉明(純度99.9%)、鹽酸安非他酮(純度99.9%)、鹽酸吡格列酮(純度100.0%)、瑞格列奈(純度99.8%)、吉非羅齊(純度99.8%)、鹽酸西布曲明(純度99.9%)、鹽酸N-單去甲基西布曲明(純度94.4%)、鹽酸N,N-雙去甲基西布曲明(純度94.4%)、鹽酸氟西汀(純度99.3%)、馬來(lái)酸羅格列酮(純度99.5%)、鹽酸偽麻黃堿(純度99.8%)、鹽酸甲基安非他明(純度99.9%)、非諾貝特(純度99.9%)、吲達(dá)帕胺(純度97.7%)、比沙可啶(純度100.0%)、鹽酸二甲雙胍(純度100.0%)、酚酞(純度99.8%)、呋塞米(純度99.3%)、氫氯噻嗪(純度99.7%)、氯噻嗪(純度100.0%)、氟伐他汀鈉(純度95.5%) 以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

GA2100離子遷移譜儀 Excellims公司;AG-1620型空氣發(fā)生器 北京科普生分析科技有限公司;XP6型微量電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;十萬(wàn)分之一天平 德國(guó)Satorius公司;超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore 公司;Branson 8510超聲清洗儀 美國(guó)Branson公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 稱取標(biāo)準(zhǔn)品各2.5 mg,分別置于25 mL量瓶中,用80%甲醇溶液溶解至刻度,配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。再用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至10 μg·mL-1,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液I;用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至10 μg·mL-1,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅱ。

1.2.1.2 樣品前處理 分別稱取減肥類保健食品(膠囊取其內(nèi)容物,茶劑、片劑和丸劑研磨后取其粉末)0.5 g研細(xì)后置于20 mL量瓶中,用80%甲醇溶液超聲提取10 min,靜置,取其上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜,即得供試品儲(chǔ)備液。量取供試品儲(chǔ)備液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度混勻,即得正離子測(cè)定樣品儲(chǔ)備液;量取供試品儲(chǔ)備液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度混勻,即得負(fù)離子測(cè)定樣品儲(chǔ)備液。

Research on developmental and motional characteristics of Daaoxi unstable rock along

正離子/負(fù)離子測(cè)定樣品溶液:取正離子/負(fù)離子測(cè)定樣品儲(chǔ)備液0.200、0.500、1.00 mL置10 mL具塞玻璃比色管中,用含0.5%乙酸(V/V)/0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度,即得稀釋50倍、25倍、10倍的樣品溶液。

1.2.2 IMS儀器參數(shù)

1.2.2.1 儀器校正 進(jìn)樣前用內(nèi)徑為1.46 mm的注射器取校正溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正(色氨酸校正時(shí)間為10.210 ms;檸檬酸校正時(shí)間為8.606 ms)。校正完后取待測(cè)溶液適量(30～50 μL)進(jìn)樣分析。

1.2.2.2 IMS 檢測(cè)條件 正離子模式下源電壓2200 V;負(fù)離子模式下源電壓1800 V。兩種模式下,進(jìn)氣口溫度均為180 ℃;遷移管電壓8000 V,遷移管溫度180 ℃;離子?xùn)砰T(mén)電壓45 V,脈沖寬度120 μs;進(jìn)樣速度1.2 μL·min-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以遷移時(shí)間(ms)為橫坐標(biāo),強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制離子遷移譜圖譜,記錄各化合物遷移峰的遷移時(shí)間和強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 IMS條件的選擇和優(yōu)化 比較了源電壓(1600～2600 V)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明,改變?cè)措妷?遷移時(shí)間不會(huì)發(fā)生改變,但會(huì)影響物質(zhì)的相對(duì)響應(yīng)。22種化合物響應(yīng)值隨源電壓變化的關(guān)系如圖1(圖1a為負(fù)離子模式;圖1b～1d為正離子模式)所示。綜合考慮,正離子模式下選取2200 V作為源電壓,負(fù)離子模式下選取1800 V作為源電壓。同時(shí)也對(duì)遷移管電壓(7500～8500 V)、門(mén)電壓、門(mén)寬度等參數(shù)進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)遷移管電壓為8000 V時(shí)峰型和分離度最好;改變門(mén)電壓和門(mén)寬度時(shí),結(jié)果變化不明顯。

圖1 不同源電壓對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)值的影響Fig.1 The effect of response values of 22 kinds of compounds at different source voltages注:a為負(fù)離子模式;b～d為正離子模式。

2.1.2 檢測(cè)模式和遷移時(shí)間 在上述優(yōu)化條件下,將1.2.1.1中標(biāo)準(zhǔn)品溶液I、Ⅱ進(jìn)行了正負(fù)離子模式測(cè)驗(yàn),結(jié)果表明,18種物質(zhì)在正離子模式下有響應(yīng),4種物質(zhì)在負(fù)離子模式下有響應(yīng),各物質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。遷移時(shí)間和約化遷移率K0(cm2·V-1·s-1)結(jié)果見(jiàn)表1。K0可根據(jù)如下公式[15]算出。根據(jù)公式,當(dāng)儀器工作參數(shù)一定時(shí),約化遷移率K0只與遷移時(shí)間td有關(guān)。

表1 22種化合物的IMS特性(n=5)Table 1 IMS characteristics of 22 compounds(n=5)

圖2 22種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的IMS圖譜Fig.2 IMS spectrograms of 22 standard solutions

其中:L(cm)為遷移管長(zhǎng)度;P(inHg)為遷移管壓強(qiáng);td(s)為遷移時(shí)間;U(V)表示遷移管電壓;Td(K)表示遷移管溫度。

2.1.3 提取溶劑的選擇和優(yōu)化 根據(jù)IMS原理,溶液中水和有機(jī)溶劑的比例會(huì)影響溶劑蒸發(fā)效率和電噴霧離子帶電效率,進(jìn)而影響物質(zhì)響應(yīng)。因此,本研究比較了各目標(biāo)化合物在不同比例甲醇溶液(60%、70%、80%、90%、100%)中的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示,在80%的甲醇溶液中基線較平,響應(yīng)較高,因此選用80%甲醇溶液作為提取溶劑。

在正離子模式下,比較了待測(cè)溶劑加酸和不加酸的測(cè)定結(jié)果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溶劑中加入適量酸會(huì)提高響應(yīng)值,負(fù)離子模式加適量氨水可以提高響應(yīng);通過(guò)比較甲酸和乙酸,以及0.2%、0.5%、1%、2%的不同酸/堿濃度,可以看出加乙酸比加甲酸基線稍平、響應(yīng)略好。在加入0.5%的乙酸(ESI+)和0.5%的氨水(ESI-)情況下,目標(biāo)物的響應(yīng)最佳。因此,最終確定正離子模式下制備溶劑為含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液;負(fù)離子模式下制備溶劑為含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液。

2.2 樣品稀釋方法的選擇

一方面,由于非法添加的化合物往往具有較高濃度,且離子遷移管有一定的記憶效應(yīng)[13],實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間使用,儀器響應(yīng)會(huì)降低,需要拆機(jī)清洗,故本試驗(yàn)選用將樣品儲(chǔ)備液稀釋不同倍數(shù),從低濃度樣品開(kāi)始采集數(shù)據(jù);另一方面,由于減肥類保健食品常見(jiàn)為減肥膠囊、減肥茶,輔料較多,易存在一定的基質(zhì)效應(yīng),為了預(yù)防假陰性的產(chǎn)生,選擇將樣品儲(chǔ)備液稀釋50、25、10倍,較文獻(xiàn)[13]稀釋得少。這樣既能減小記憶效應(yīng),預(yù)防離子源的污染,又兼顧靈敏度。

2.3 專屬性考察

選取該實(shí)驗(yàn)40批減肥類保健食品中,用液相色譜法未檢出非法添加的37批陰性樣品,進(jìn)行IMS分析,未發(fā)現(xiàn)在22個(gè)減肥類藥物出峰的位置出現(xiàn)干擾峰;3批陽(yáng)性樣品均檢出相應(yīng)的非法添加物,表明方法專屬性良好。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和靈敏度的考察

由于保健食品基質(zhì)的存在,基質(zhì)中存在的離子未經(jīng)過(guò)色譜分離直接進(jìn)入離子遷移譜的電噴霧離子源易出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)[22]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),樣品基質(zhì)對(duì)離子遷移譜測(cè)定22種減肥類化合物的干擾主要為基質(zhì)抑制效應(yīng),且不同化合物在不同基質(zhì)中差異較大。以鹽酸西布曲明(正離子模式)和呋塞米(負(fù)離子模式)為例,膠囊、茶劑、片劑陰性樣品各選一批,按照1.2.1.2制備稀釋10、25、50倍的樣品溶液,進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo),西布曲明的峰高強(qiáng)度約為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的75%～105%,而呋塞米約為20%～70%,而峰寬和遷移時(shí)間的SD值與對(duì)照品沒(méi)有顯著性差異。

故檢出限的判定使用基質(zhì)加標(biāo)法,選擇膠囊、茶劑、片劑陰性樣品各一批,按照1.2.1.2的前處理方法操作,得到空白基質(zhì)溶液(樣品儲(chǔ)備液稀釋50倍)。吸取一定量1.2.1.1的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用空白基質(zhì)溶液對(duì)該液逐級(jí)稀釋,以信噪比(S/N)為3時(shí)的檢出濃度作為檢出限(LOD),選擇檢出限最差的結(jié)果作為該物質(zhì)的檢出限,見(jiàn)表1。

由于鹽酸甲基安非他明和鹽酸二甲雙胍的遷移時(shí)間與樣品溶劑峰遷移時(shí)間較接近,因此在少量濃度時(shí),目標(biāo)化合物的峰會(huì)混于樣品溶劑峰里不易區(qū)分;只有當(dāng)目標(biāo)化合物達(dá)到一定濃度,其峰的響應(yīng)值大于溶劑峰響應(yīng)值時(shí),才會(huì)于溶劑峰中凸顯出來(lái)(圖3),因此原本在單一對(duì)照中響應(yīng)較好的安非他明和二甲雙胍在基質(zhì)匹配溶液中檢出限都略高,均為1.5 mg/L;負(fù)離子模式下的呋塞米、氫氯噻嗪、氯噻嗪、氟伐他汀鈉由于基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng),所以檢出限濃度也較大,呋塞米檢出限為8 mg/L,氫氯噻嗪為3 mg/L,氯噻嗪、氟伐他汀鈉為5 mg/L。但由于實(shí)際樣品中非法添加含量一般較高,甚至可達(dá)g/L,因此該類物質(zhì)的檢出限足以能判斷是否有非法添加物。

圖3 樣品基質(zhì)中二甲雙胍(a)和甲基安非他明(b)檢出限測(cè)定的IMS圖Fig.3 IMS image of detection limit of metformin and methamphetamine in sample matrix

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定和譜庫(kù)的建立

儀器軟件自帶譜庫(kù)建立和檢索功能,可以在譜庫(kù)中添加化合物名稱和校正后的離子遷移譜信息并保存,直接用于同種型號(hào)、同種測(cè)定條件下不同儀器之間的數(shù)據(jù)比較,實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享,特別適合用于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)非法添加物質(zhì)的篩查。

取1.2.1.2中配制的不同稀釋倍數(shù)的樣品溶液,按稀釋倍數(shù)50、25、10倍的順序分別在正負(fù)離子模式下測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有3批樣品除溶劑峰外,稀釋50倍即有明顯的非法添加峰:正離子模式下有1批(膠囊1)在12.205 ms處檢測(cè)出非法添加物,與已建譜庫(kù)核對(duì),疑似非法添加物為西布曲明或吉非羅齊;正離子模式下有1批(膠囊2)在12.360 ms處檢測(cè)出非法添加物,與已建譜庫(kù)核對(duì),疑似非法添加物為酚酞;正離子模式下有1批(膠囊3)在12.744 ms處檢測(cè)出非法添加物,與已建譜庫(kù)核對(duì),疑似非法添加物為氟西汀。采用實(shí)驗(yàn)室已建立的HPLC-IT-TOF法的測(cè)定上述樣品,結(jié)果膠囊2和膠囊3確檢出酚酞和氟西汀,如圖4所示;而膠囊1除了檢出鹽酸西布曲明,與離子遷移譜測(cè)定結(jié)果一致以外,還有少量的酚酞,初篩(稀釋50倍)被忽略了。重新同時(shí)測(cè)定稀釋50、25、10倍的樣品溶液,如圖5所示,依然不能判斷出含有酚酞,可能是由于2種物質(zhì)峰位接近,鹽酸西布曲明的比酚酞量大且靈敏度高,淹沒(méi)了酚酞的信號(hào)。其余37批樣品未檢出與文中所列標(biāo)準(zhǔn)品一致的色譜峰,與離子遷移譜測(cè)定結(jié)果一致。

圖4 膠囊2和膠囊3的IMS圖(正離子模式)Fig.4 IMS diagram of capsule 2 and 3(positive ion mode)

圖5 膠囊1的IMS圖(正離子模式)Fig.5 IMS diagram of capsule 1(positive ion mode)

3 討論與結(jié)論

保健食品中非法添加現(xiàn)象屢禁不止,而以非法添加為目的的專項(xiàng)抽查需要有針對(duì)性,以免浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)室資源,本研究針對(duì)22種減肥類非法添加物質(zhì),建立了一種快速、高效的電噴霧-離子遷移譜檢測(cè)方法,目的在于現(xiàn)場(chǎng)抽樣時(shí)的快速篩查。相比于體積龐大、操作繁瑣,受限于實(shí)驗(yàn)室操作的LC-MS等常用分析設(shè)備,以及化學(xué)試劑盒種類繁多,結(jié)果時(shí)效性短,判斷誤差大,建立的離子遷移譜法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短。在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),只需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的溶劑提取,即可在1 min內(nèi)完成檢測(cè);在數(shù)據(jù)分析時(shí),可直接利用已建譜庫(kù)進(jìn)行非法添加物的篩查,不必再配備標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果較現(xiàn)有的化學(xué)試劑盒、薄層色譜法等現(xiàn)場(chǎng)篩查法更快速,通用性、穩(wěn)定性和耐用性更好。盡管離子遷移譜有許多優(yōu)點(diǎn),但也存有不足之處。首先,離子遷移譜主要是靠遷移時(shí)間來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行定性,在準(zhǔn)確定量方面必然不能與目前標(biāo)準(zhǔn)的LC-MS方法相比;其次,定性參數(shù)遷移時(shí)間的分析窗口較窄,當(dāng)一些同種類非法添加物遷移時(shí)間太過(guò)接近時(shí)會(huì)不易區(qū)分;再次,樣品基質(zhì)中有些難以判斷的基質(zhì)干擾峰,可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。但是,現(xiàn)場(chǎng)初篩并不是最終判定手段,盡可能避免假陰性,允許一定假陽(yáng)性的出現(xiàn),雖然減肥類保健食品基質(zhì)繁多,但是某個(gè)遷移峰明顯,即說(shuō)明某些物質(zhì)物質(zhì)含量很高,且有與譜庫(kù)相符的異常峰出現(xiàn),無(wú)論添加物為A或B,即可初步判定該樣品為問(wèn)題樣品,抽樣后待實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步確證。因此,離子遷移譜作為初篩工具,其更適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查,可大大縮短現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)間、提高效率,為監(jiān)管決策部門(mén)提供技術(shù)保障和執(zhí)法依據(jù)。