,2,*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 511400;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室,廣東廣州 511400)

何首烏別名首烏、赤首烏,是蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb的干燥塊根[1],其藥用初載于《開(kāi)寶本草》,歸肝、心、腎經(jīng)。依據(jù)炮制方法的不同,可分為生何首烏和制何首烏,其功效有所不同:生何首烏通便、消癰腫、解瘡毒;制何首烏可補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨[1]。作為傳統(tǒng)的藥食兩用藥材,在衛(wèi)生部公布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中,制何首烏入選《可用于保健食品的物品名單》。何首烏市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿薮?有效區(qū)分和快速辨別何首烏的生熟及炮制程度,對(duì)何首烏進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

用于何首烏質(zhì)量和炮制程度的評(píng)價(jià)方法主要有化學(xué)成分分析[2-4]、體內(nèi)外活性研究[5-8]等。常用的分析方法有TLC、HPLC含量測(cè)定[9-10]和指紋圖譜[11-12]等,均需較繁瑣的樣品前步驟。近年來(lái),以仿生技術(shù)為代表的中藥快速分析技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、無(wú)損樣品以及快速分析等優(yōu)勢(shì)得到了快速發(fā)展[13]?，F(xiàn)代仿生技術(shù)主要包括電子鼻、電子舌和電子眼,其中電子眼,即色差計(jì),特別適用于食品[14]和藥物[15]在炮制方面的色澤量化。

顏色是區(qū)別制何首烏和生何首烏的重要指標(biāo),顏色變化能在一定程度上表征飲片中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化,測(cè)定顏色值可避免化學(xué)成分測(cè)定受限以及單一成分無(wú)法判斷藥材整體質(zhì)量的問(wèn)題。二苯乙烯苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)、磷脂類(lèi)、多糖是何首烏中主要化學(xué)成分[16-18],在炮制加熱過(guò)程中,結(jié)合蒽醌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x蒽醌類(lèi)[19-20],多糖分解成還原糖進(jìn)而引發(fā)美拉德反應(yīng)(Millard reaction)導(dǎo)致藥材顏色變化[21-22];而二苯乙烯苷類(lèi)等其他成分,與何首烏飲片顏色變化相關(guān)性不強(qiáng),不入選本研究的測(cè)定指標(biāo)。

鑒于目前對(duì)何首烏炮制程度的評(píng)價(jià)缺乏快速直觀的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法,本文以廣東德慶道地產(chǎn)區(qū)何首烏為研究對(duì)象,采用色差計(jì)對(duì)何首烏粉末顏色進(jìn)行客觀的量化分析,以何首烏顏色值、游離總多糖和總蒽醌為指標(biāo),評(píng)價(jià)其質(zhì)量?，F(xiàn)代研究表明,肝臟是何首烏的敏感器官,因此本研究還探討了不同炮制程度何首烏對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)何首烏飲片顏色、成分含量及與體外細(xì)胞活性的相關(guān)性分析,評(píng)價(jià)何首烏的炮制程度,實(shí)現(xiàn)中藥何首烏炮制品快速無(wú)損評(píng)價(jià)的客觀化和數(shù)字化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

何首烏飲片 購(gòu)于廣東德慶,由廣東藥科大學(xué)李書(shū)淵教授鑒定為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)干燥塊根;D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):10833-200503)、1,8-二羥基蒽醌對(duì)照品(批號(hào):CHB180224)、醋酸鎂 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;HepG2細(xì)胞系 CC0101,購(gòu)自廣州賽庫(kù)公司,在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,于37 ℃ 5% CO2進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行;DMEM高糖培養(yǎng)基 賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司。

MJ-78A全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 上海飛迪生物科技公司;SQP十萬(wàn)分之一天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;CR-410色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)公司;UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;ELX800酶標(biāo)儀 BioTek Instruments。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同何首烏樣品的制備 按2015版《中國(guó)藥典》[1]通則0213制備何首烏飲片炮制品。取蒸餾水潤(rùn)透何首烏飲片于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),溫度設(shè)置為120 ℃,蒸制30 min,壓力為0.15 MPa,取出,稍晾,翻拌至汁液吸凈,置電熱鼓風(fēng)干燥箱40 ℃干燥10 h。重復(fù)蒸制干燥步驟,制備不同炮制次數(shù)何首烏飲片,標(biāo)記為P0～P9(其中P0(Processed zero)表示為何首烏生品,P1表示為炮制一次的何首烏,以此類(lèi)推)。

精密稱(chēng)取何首烏飲片P0～P9各30 g,以300 mL水煎煮2次,每次1.5 h,濾過(guò),合并濾液,于100 ℃下濃縮至10 mL(原體積的1/60),得1 g/mL(生藥濃度)水提液,以硫酸-苯酚顯色法測(cè)總多糖含量,MTT法測(cè)細(xì)胞增殖率的影響。

分別精密稱(chēng)取何首烏飲片P0、P3、P6、P9各30 g,以300 mL 95%乙醇回流提取,同法得到醇提液,以醋酸鎂甲醇顯色法測(cè)總蒽醌含量,MTT法測(cè)細(xì)胞增殖率的影響。

1.2.2 顏色值的測(cè)定 取約30 g何首烏樣品粉碎,過(guò)65目篩得到何首烏細(xì)粉。取約2.5 g何首烏細(xì)粉于石英樣品杯輕輕振搖使分布均勻,以積分球漫反射法重復(fù)測(cè)量3次,取平均數(shù)。色差計(jì)測(cè)定條件為光源D65,標(biāo)準(zhǔn)觀察角2度,照明口徑50 mm,分辨分辨率8 cm-1,掃描次數(shù)64次,溫度(25±2) ℃,相對(duì)濕度45%～50%。以顏色明度值L*、紅綠色值a*、黃藍(lán)色值b*、總色值E*ab進(jìn)行色澤量化[23]。

1.2.3 何首烏炮制過(guò)程中化學(xué)成分的測(cè)定

1.2.3.1 總多糖含量的測(cè)定 精密稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.02 mg,加水制成0.01004 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液,備用。取1 mL水提液,稀釋,作為何首烏水提供試品溶液,備用。

準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別加入純水至1.0 mL,迅速加入顯色劑(1 mL 5%苯酚水溶液和5 mL濃硫酸),60 ℃水浴30 min,冰浴30 min,置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于486.5 nm處測(cè)其吸光度[24]。

精密稱(chēng)取水提液1 mL,按照上述方法顯色后,以濃硫酸苯酚溶液為空白對(duì)照,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在486.5 nm下測(cè)其吸光度,計(jì)算總多糖含量和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3.2 游離總蒽醌含量的測(cè)定 精密稱(chēng)取1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品4.36 mg,加0.2%的醋酸鎂甲醇溶解制成0.436 mg/mL的1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液,備用。取1 mL何首烏醇提液,加0.2%醋酸鎂甲醇溶液稀釋,作為何首烏醇提供試品溶液,備用。

準(zhǔn)確吸取1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.60、0.80 mL分別置于5 mL容量瓶中,加入0.2%醋酸鎂甲醇定容搖勻。以0.2%醋酸鎂甲醇作為空白對(duì)照溶液,在511 nm處測(cè)其吸光度[25]。

精密稱(chēng)取何首烏醇提供試品溶液1 mL,按上述方法顯色,以醋酸鎂溶液為空白對(duì)照,置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于511 nm下測(cè)定,計(jì)算游離總蒽醌含量和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

總蒽醌相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=制何首烏總蒽醌含量/生何首烏總蒽醌含量×100

1.2.4 何首烏提取液對(duì)細(xì)胞體外增殖活性影響 取1.2.1得到的水提液,分別用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成生藥濃度為10、1 mg/mL,用0.22 μm微孔濾器除菌。

將消化下來(lái)的細(xì)胞按2×105cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μL,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入配好的何首烏水提液200 μL,培養(yǎng)24 h后棄去藥液,加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,孵育4 h,棄去MTT溶液,加DMSO 150 μL震搖15 min,置酶標(biāo)儀490 nm下測(cè)定,計(jì)算細(xì)胞增殖率,應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

用DMEM高糖培養(yǎng)基將得到的何首烏醇提液稀釋成生藥濃度為12.5 mg/mL,用0.22 μm微孔濾器除菌。將消化下來(lái)的細(xì)胞按2×105cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μL,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入配好的何首烏醇提液200 μL,分別培養(yǎng)24、48 h。檢測(cè)步驟同上所述。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 21.0軟件做統(tǒng)計(jì)描述和相關(guān)性分析,采用GraphPad Prism 5作圖,用SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘回歸分析(PLS)等數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多糖的線性線性范圍及含量測(cè)定

以葡萄糖對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)(c,mg/mL),以吸光度為縱坐標(biāo)(A),得回歸方程為:Y=9.2001X-0.013(R2=0.9994),結(jié)果表明,葡萄糖終濃度在0.0014～0.0115 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。何首烏飲片P0～P9水提液總多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。炮制會(huì)引起何首烏多糖含量的變化:生何首烏多糖含量最低,只有0.343%;在炮制零次～炮制六次期間,多糖含量總體呈現(xiàn)較快的上升趨勢(shì),在炮制六次～炮制八次時(shí)增長(zhǎng)速率達(dá)到平臺(tái)期,此時(shí),多糖含量達(dá)到最大,在0.783%～0.792%之間,與生首烏相比,此時(shí)多糖含量上升了2.3倍左右。何首烏在第九次炮制時(shí),多糖含量出現(xiàn)下降的情況,這可能是還原糖轉(zhuǎn)化為類(lèi)黑精或揮發(fā)性成分所致[26]。

表1 何首烏飲片顏色值及化學(xué)成分含量Table 1 Color determination and chemical components contents of Polygonum multiflorum Thunb

2.2 游離總蒽醌的線性線性范圍及含量測(cè)定

以1,8-二羥基蒽醌對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)(c,mg/mL),以吸光度為縱坐標(biāo)(A),得回歸方程為:Y=37.305X-0.01(R2=0.9993),結(jié)果表明,1,8-二羥基蒽醌在0.0005～0.0174 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。何首烏飲片P0、P3、P6、P9醇提液總游離蒽醌含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。炮制也會(huì)引起藥材總蒽醌含量的變化,蒽醌含量為P9>P6>P3>P0,說(shuō)明游離蒽醌含量也隨著炮制次數(shù)的增加而變化(見(jiàn)圖1),這可能是由于何首烏在高溫炮制過(guò)程中結(jié)合蒽醌水解成游離蒽醌[27]。

圖1 何首烏炮制過(guò)程中多糖、總蒽醌含量的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Relative content variation of total polysaccharide and total anthraquinone in processing of Polygonum multiflorum Thunb

2.3 樣品顏色值測(cè)定數(shù)據(jù)

L*表示明度值,L*值越大越白,反之則越黑;a*表示紅綠色值,a*值越大越紅,反之則越綠;b*表示黃藍(lán)色值,b*值越大越黃,反之則越藍(lán)[28]。在D65光源下,色差值L*介于33.76～44.26之間,a*介于3.28～4.75之間,b*介于0.93～8.27之間;相較生品,何首烏在高壓清蒸炮制過(guò)程中,樣品色差值L*、a*、b*、E*ab均呈下降趨勢(shì),表明何首烏在炮制過(guò)程中亮度變暗,偏綠、藍(lán)色澤。何首烏炮制樣品較生品顏色深,可能是由于在高壓炮制過(guò)程中何首烏多糖類(lèi)成分和氨基酸發(fā)生了美拉德反應(yīng),使何首烏發(fā)生了由黃色轉(zhuǎn)呈黑褐色的非酶促褐變過(guò)程[29]。

2.4 何首烏提取液對(duì)細(xì)胞體外增殖活性影響

水提液對(duì)細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用(圖2),醇提液對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)影響(圖3)。何首烏提取液不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)體外細(xì)胞增殖活性結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 何首烏提取液對(duì)細(xì)胞增殖的影響(%,n=5)Table 2 Effects of Polygonum multiflorum Thunb extracts on cell proliferation rate(%,n=5)

圖2 何首烏水提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of Polygonum multiflorum Thunb water extract on cell proliferation rate

圖3 何首烏醇提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of Polygonum multiflorum Thunb ethanol extract on cell proliferation rate

何首烏水提液對(duì)細(xì)胞增殖存在顯著促進(jìn)作用(P<0.05),各不同炮制階段(P7除外)的MTT結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),高濃度組(10 mg/mL)細(xì)胞增殖率高于低濃度組(1 mg/mL)。在低濃度組,炮制的何首烏細(xì)胞增殖率增長(zhǎng)速度呈先上升再下降的趨勢(shì),何首烏在炮制七次時(shí),細(xì)胞增殖率最高,達(dá)153.14%;在高濃度組,細(xì)胞增殖率在135.53%～150.67%之間,均能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,說(shuō)明何首烏水提液高濃度組體外活性更好。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度何首烏醇提液對(duì)細(xì)胞體外增殖率在102.27%～122.53%之間,均無(wú)顯著性影響,故選用較高濃度(12.5 mg/mL)何首烏醇提液分別給藥24和48 h檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的影響。因此,何首烏醇提液體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不作為活性相關(guān)性分析的數(shù)據(jù)來(lái)源。

2.5 何首烏炮制品顏色-成分含量的相關(guān)性分析

分別以總多糖、總蒽醌含量為因變量,以色差值L*、a*、b*、E*ab為自變量,利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表3。游離總多糖含量與L*、b*和E*ab值在0.05水平上存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,游離總蒽醌含量與色差值a*在0.01水平上存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,即在一定程度上,炮制次數(shù)越高,色差值越小,何首烏中總多糖和總蒽醌含量越高。對(duì)SPSS 21.0軟件進(jìn)行回歸分析,得回歸方程:Y(總多糖含量)=1.362-0.013L*-0.032a*-0.036b*,可通過(guò)何首烏炮制的顏色值快速預(yù)測(cè)總多糖含量。

表3 化學(xué)成分含量與顏色的相關(guān)性分析(n=10)Table 3 Pearson correlation analysis of apparent color and chemical components(n=10)

2.6 何首烏炮制品顏色-成分-活性的關(guān)聯(lián)分析

以何首烏游離總多糖含量,色差值L*、a*、b*、E*ab和細(xì)胞增殖活性為變量,用Simcap 14.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA),結(jié)果見(jiàn)圖4。分析結(jié)果顯示,以顏色值和總多糖為變量時(shí),可將9批不同程度的何首烏炮制飲片分為3組,即炮制一次到炮制三次為一組,炮制四次到炮制五次為一組,炮制六次到炮制九次為一組。以PCA的結(jié)果對(duì)細(xì)胞增殖率建立偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)模型(如圖5)對(duì)何首烏飲片的分組更為細(xì)致,可將9批不同程度的何首烏炮制飲片分為5組,從分組可知炮制六次和炮制九次為歸為一組,推測(cè)可能是炮制到某個(gè)程度后,何首烏的量效到達(dá)一定閾值,再增加炮制次數(shù)并不能提高何首烏飲片多糖含量及體外細(xì)胞增殖率,甚至出現(xiàn)下降的趨勢(shì),因此可認(rèn)為何首烏高壓清蒸的最佳炮制程度為炮制六次到炮制八次。通過(guò)PLS建立了何首烏飲片細(xì)胞活性與顏色值、游離總多糖偏最小二乘回歸模型:Y=0.434X1-0.239X2+0.317X3+0.235X4(Y為細(xì)胞活性,X1～X4分別為色差值L*、色差值a*、色差值b*、游離總多糖含量)。由本模型結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知,何首烏飲片炮制一次到炮制八次后其Y值介于14.7～17.2之間,而生何首烏和九次炮制何首烏的Y值分別是19.9、14.3;結(jié)合表1、表2數(shù)據(jù)得,Y值14.7～17.2數(shù)據(jù)區(qū)間何首烏多糖含量較高,細(xì)胞活性較好。由此可知,該模型可通過(guò)代入何首烏炮制品的顏色值和游離總多糖含量快速預(yù)測(cè)其細(xì)胞增殖活性,評(píng)估何首烏的等級(jí)。

R2×[1]=0.367 R2×[2]=0.106Ellipse:Hotelling’s T2(95%)圖4 顏色-游離總多糖PCA分布圖Fig.4 Scatter score plot of PCA of color-total polysaccharide-viability

R2×[1]=0.340 R2×[2]=0.122Ellipse:Hotelling’s T2(95%)圖5 顏色-游離總多糖-活性PLS-DA分布圖Fig.5 Scatter score plot of PLS-DA of color-total polysaccharide-viability

3 討論

何首烏是我國(guó)一種傳統(tǒng)常用中藥材,也是食療保健之佳品。何首烏含有15種氨基酸、豐富的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素、9種維生素和13種苷磷脂等[30],有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。何首烏生熟異用,快速辨別何首烏的炮制程度,對(duì)其資源的綜合利用、完善質(zhì)量評(píng)價(jià)等具有重要意義。

本文應(yīng)用色差計(jì)對(duì)不同炮制批次何首烏飲片進(jìn)行辨色,實(shí)現(xiàn)何首烏飲片傳統(tǒng)性狀的量化描述(L*,a*,b*);采用分光光度法測(cè)定何首烏飲片提取液中游離總多糖含量和游離蒽醌含量。對(duì)何首烏外觀顏色與內(nèi)在化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)色差值L*、b*、E*ab與總多糖含量存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,a*與總蒽醌含量存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,即隨著顏色的加深(總色差值E*ab降低),總多糖呈先明顯上升后穩(wěn)定的趨勢(shì),而總蒽醌含量呈上升趨勢(shì)。對(duì)何首烏顏色-總多糖-活性進(jìn)行PLS-DA分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)炮制到一定程度后,何首烏飲片六制和九制的顏色-總多糖-活性相重疊,炮制達(dá)到第九次時(shí),何首烏飲片的體外活性及化學(xué)成分呈現(xiàn)下降趨勢(shì),據(jù)此推斷何首烏高壓炮制的最佳次數(shù)為六次～八次。

鑒于何首烏炮制品內(nèi)在質(zhì)量存在較大差異的現(xiàn)狀,本實(shí)驗(yàn)基于“表里關(guān)聯(lián)”思路,將何首烏外觀顏色與游離總多糖和總蒽醌含量及對(duì)細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)弱相關(guān)聯(lián),建立PLS偏最小二乘回歸模型,對(duì)何首烏炮制程度進(jìn)行分組,為常用中藥何首烏快速無(wú)損質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考,為中藥炮制過(guò)程監(jiān)控及質(zhì)量控制研究提供新思路。