李建樹，孫麗坤，韓向敏，張明盩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市畜禽育種推廣中心，甘肅 蘭州 730000)

我國是畜禽養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)業(yè)種植大國，而畜禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的大量糞便及農(nóng)作物秸稈焚燒會對環(huán)境造成嚴重的污染[1-2].而微生物堆肥是農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖廢棄物處理的最佳方式之一，可將糞便及秸稈轉(zhuǎn)化為更安全、更穩(wěn)定的肥料[3-4].

在微生物堆肥中，通過調(diào)節(jié)原料最初的碳氮比來滿足微生物的生長需要，提高堆肥效率[5].農(nóng)作物秸稈中含有大量的木質(zhì)纖維素，然而木質(zhì)纖維素結(jié)構復雜，是制約堆肥效果的關鍵因素[6-7].高溫堆肥能夠使堆肥中絕大多數(shù)木質(zhì)纖維素等高分子化合物結(jié)構斷裂或分解[8-9]，但高溫會使大量微生物受到抑制或死亡，影響堆肥中木質(zhì)纖維素的降解[10-11].研究結(jié)果表明，添加纖維素降解微生物，特別是高溫降解微生物，能夠加快纖維素降解，促進堆肥腐熟，提高堆肥效率[12-15].大多數(shù)真菌在堆肥溫度高于50 ℃時死亡，嗜熱真菌保持在較低水平，通常細菌為主要的分解微生物[16-17].目前國內(nèi)在高溫纖維素降解微生物的研究主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物，如枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)等，而單一菌種的降解能力有限，且不穩(wěn)定[14，18-20].所以，進一步篩選出能夠適應高溫，且在高溫條件下高產(chǎn)纖維素酶的纖維素降解真菌及其他屬的纖維素降解細菌的研究是非常必要的.

本試驗以采自自然堆肥的牛糞樣品為菌源，在50 ℃條件下以CMC-Na為唯一碳源進行富集、篩選高溫纖維素降解微生物.并在50 ℃培養(yǎng)條件下進行其酶活力及濾紙降解能力研究，旨為構建高效纖維素降解復合菌系及研制高溫堆肥菌劑奠定基礎，為畜禽糞便和農(nóng)作物秸稈資源化利用的堆肥技術提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 牛糞采自蘭州市榆中縣吉將牧業(yè)科技有限公司的自然堆肥中，玉米秸稈采自蘭州永登縣.

1.1.2 試劑及儀器 羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、剛果紅、肉湯培養(yǎng)基、細菌真菌基因組DNA提取試劑盒，DNS試劑、檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L pH 4.5)、1%CMC-Na溶液、1%微晶纖維素溶液、定量濾紙.

高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、臺式高速冷凍離心機、PCR儀、微量分光光度計(NanoDrop).

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基參考文獻[21]所述配置.細菌的分離及純化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.真菌的分離及純化采用馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基(PDA).剛果紅培養(yǎng)基參考文獻[22](略作改動)配制：K2HPO4為0.5 g/L，MgSO4·7H2O為0.25 g/L，微晶纖維素為1.88 g/L，剛果紅為0.3 g/L，明膠為2 g/L，瓊脂為20 g/L，pH7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.濾紙條無機鹽培養(yǎng)基參考文獻[23]配置.液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[24]：取2 g烘干成恒質(zhì)量的玉米稈(長度1 cm左右)，加入到Mandel’s無機鹽營養(yǎng)液，KH2PO4為1.0 g/L，(NH4)2SO4為3.00 g/L，MgSO4·7H2O為0.4 g/L，CaCl2為0.1 g/L，F(xiàn)eCl3為0.01 g/L，NaCl為0.20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的篩選 稱取5 g樣品加入到100 mL含有CMC-Na的富集培養(yǎng)基中，120 r/min，50 ℃恒溫震蕩富集，在培養(yǎng)基變渾濁后，吸去2 mL轉(zhuǎn)移至新的富集培養(yǎng)基中進行多次富集.取1 mL稀釋成10-3、10-4、10-5和10-64個梯度，再依次吸去100 μL分別涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏一號、PDA培養(yǎng)基平板上50 ℃恒溫培養(yǎng).待平板上長出菌落1 d后，挑選形態(tài)不同的單菌落進行分離純化.將純化好的菌株接種至剛果紅培養(yǎng)基上進行篩選，根據(jù)培養(yǎng)基上水解圈的直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)，選取效果較好的進行下一步研究(濾紙條崩解試驗).

將初選得到的菌株接種至液體培養(yǎng)基中50 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD值至0.6.在98 mL濾紙條培養(yǎng)基中接入2 mL菌液，在50 ℃、80 r/min下培養(yǎng)7 d，空白組不接種菌種，每組3個重復.根據(jù)濾紙條的斷裂崩解程度及降解率來判斷菌株的降解性能.

1.2.2 酶活力的測定 標準曲線的繪制參考文獻[25-27]，以吸光度為縱坐標，以溶液濃度橫坐標，繪出標準曲線(圖1).最終測得葡萄糖標準曲線為y=0.783 6x-0.030 5(R2=0.995).

圖1 葡萄糖標準曲線Figure 1 Glucose standard curve

粗酶液的制備 在三角瓶中裝入98 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將篩選的菌株菌液吸取2 mL接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，180 r/min、50 ℃振蕩培養(yǎng).在培養(yǎng)2、3、4、5、6、7 d時取培養(yǎng)液，培養(yǎng)液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液為粗酶液.

羧甲基纖維素酶活(CMCase)測定[25]取1 mL稀釋后的粗酶液(5倍)至試管中，加1 mL 1%CMC-Na溶液和1 mL檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L pH 4.5)，混勻后，于50 ℃水浴30 min，然后加入DNS顯色液1.5 mL立即沸水浴5 min，冷卻后定容至20 mL后在530 nm比色.同時用100 ℃煮沸10 min后失活的酶液做對照，其他步驟相同，每組3個平行.

濾紙酶活(FPA)測定[26]同羧甲基纖維素酶活測定，將底物CMC-Na溶液換為1 cm×6 cm濾紙，其它步驟相同.

微晶纖維素酶C(1)活測定[27]吸取1 mL稀釋后的粗酶液(5倍)至刻度試管中，加入1 mL的檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L pH 4.5)和1 mL 1%微晶纖維素溶液，50 ℃反應120 min，6 000 r/min離心10 min除去沉淀.然后取1 mL反應上清液用DNS法測定還原糖(同羧甲基纖維素酶活測定).

1.2.3 分子生物學鑒定 菌株的DNA提取 按照細菌基因組提取試劑盒和真菌基因組提取試劑盒的操作步驟分別提取菌株的基因組DNA.提取的DNA用NanoDrop檢測濃度(ng/μL)及純度(A260/A280)，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性.

PCR擴增及測序 以提取的細菌基因組DNA為模板，選用細菌通用引物(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增.擴增體系(25 μL)為DNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL.程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.真菌通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增.擴增體系(25 μL)為DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL.程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.

PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析儀觀察結(jié)果.將陽性PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司利用Sanger法進行16S rDNA和ITS測序分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel2010對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理和圖表的繪制.用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，測序結(jié)果在NCBI(National Center of Biotechnology Information)上用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序與GenBank中微生物基因序列進行同源性分析.

在NCBI中下載比對相似度高的序列及種屬參考序列，用Mega7.0進行序列比對分析后，用Phylogeny菜單中的Construct/Test Neighbor-joining Tree方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解微生物的分離與篩選

將牛糞堆肥在50 ℃下，4代富集培養(yǎng)以后，將稀釋液涂布、分離純化培養(yǎng)5代后得到4株真菌和5株細菌.

將純化得到9株菌株在剛果紅培養(yǎng)基上，篩選出5株水解圈與菌落直徑比值大于2.0的菌株用于復選(表1).菌株Z-3在剛果紅平板上相對較好，菌落直徑較大(圖2).

由表1可知，初選的5株菌，在50 ℃恒溫培養(yǎng)下在2 d時能夠在剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生較好的水解圈.水解圈直徑和菌落直徑比(D/d)從大到小依次為X-3、X-4、X-5、X-1、Z-3，菌株X-3、X-4、X-5水解圈直徑和菌落直徑比(D/d)顯著高于X-1和Z-3.D/d越大，說明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶活性越高，纖維素酶量越大.因此，可以通過D/d的大小初步判斷菌株的降解效果，但不能完全代表菌株的產(chǎn)酶能力和菌株降解纖維素的效果.

圖2 菌株X-1和Z-3在剛果紅培養(yǎng)基上的生長情況Figure 2 Growth of strains X-1 and Z-3 on Congo red medium

表1 纖維素降解微生物的初選結(jié)果

通過將初選得到的5株菌接種到濾紙條培養(yǎng)基中，50 ℃恒溫培養(yǎng)7 d測定濾紙條的崩解程度.測定結(jié)果表明菌株X-1在第5天能夠?qū)V紙完全崩解，Z-3能夠在7 d內(nèi)將濾紙完全降解為糊狀，降解效果如圖3所示.其他3株菌7 d時只能使濾紙的邊緣膨脹，幾乎沒有降解效果(表2)，而Z-3、X-1、X-3、X-4、X-5的濾紙降解率(7 d)分別為18.86%、16.37%、2.27%、1.89%、0.60%，可看出菌株Z-3和X-1對濾紙具有一定的降解效果，而其它菌株基本對濾紙沒有降解效果，將它們淘汰，如圖4所示，

表2 菌株的菌落形態(tài)及復選

A：菌株X-1；B：菌株Z-3；C：空白對照；D：菌株X-5；E：菌株X-3；F：菌株X-4.A：Strain X-1；B：Strain Z-3；C：Blank control；D：Strain X-5；E：Strain X-3；F：Strain X-4.圖3 X-1和Z-3在7 d時對濾紙的降解效果Figure 3 Degradation effect of X-1 and Z-3 on filter paper at 7 d

圖4 菌株X-1和Z-3的菌落形態(tài)特征Figure 4 Morphology characteristics of strains X-1 and Z-3

菌株X-1和Z-3在50 ℃培養(yǎng)的條件下，在肉湯培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長較高.菌株X-1和Z-3對濾紙的降解效果較好，有較好的研究效果.

2.2 菌株X-1和Z-3羧甲基纖維素酶活、濾紙酶活和微晶纖維素酶活的測定

經(jīng)過濾紙條降解試驗篩選出的2株降解濾紙效果較好的菌株X-1、Z-3，測定這2株菌的酶活.由圖5、圖7可知，X-1的羧甲基纖維素酶活(CMCase)和微晶纖維素酶活(C1)第2天開始上升，第5天分別達到0.47、0.12 IU/mL，5 d以后開始下降.濾紙酶活(FPA)第3天達到最高0.08 IU/mL，之后開始下降.由圖4、5、6可知，菌株Z-3初期酶活呈上升趨勢到4～5 d達到最高，之后開始下降.Z-3的羧甲基纖維素酶活(CMCase)、濾紙酶活(FPA)、微晶纖維素酶活(C1)在7 d內(nèi)最高值分別為0.32、0.14、0.07 IU/mL.在7 d內(nèi)X-1的羧甲基纖維素酶活(CMCase)和微晶纖維素酶活(C1)整體高于Z-3，X-1的濾紙酶活(FPA)第2、3天略高于Z-3，第4～7天低于Z-3.整體2株菌的羧甲基纖維素酶活(CMCase)顯著大于濾紙酶活(FPA)和微晶纖維素酶活(C1).

圖5 培養(yǎng)時間對菌株X-1和Z-3CMC酶活的影響Figure 5 Effects of culture time on enzyme activities of strains X-1 and Z-3 CMC

圖6 培養(yǎng)時間對菌株X-1和Z-3濾紙酶活的影響Figure 6 Effect of culture time on enzyme activity of strain X-1 and Z-3 filter paper

圖7 培養(yǎng)時間對菌株X-1和Z-3微晶纖維素酶活的影響Figure 7 Effect of the culture time on the enzyme activity of the bacterial strain X-1 and Z-3 microcrystalline cellulose

2.3 菌株分子的生物學鑒定

PCR產(chǎn)物在凝膠電泳后，菌株X-1的16S擴增片段大小在1 500 bp左右，菌株Z-3的擴增片段大小在550 bp左右(圖8).將陽性PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，所得X-1的16S擴增序列長度為1 424 bp，Z-3的序列長度為554 bp，與預期結(jié)果相近.測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，其同源性都為100%.利用MEGA7.0的Neighbor-Joining 構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖9～10)，結(jié)合菌株的菌落形態(tài)特征和基因序列比對分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定菌株X-1為伯氏短桿菌(Brevibacillusborstelensis)，菌株Z-3為枝孢菌屬(Cladosporium).

圖8 菌株16S rDNA和ITS瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 8 Agarose get electrophoresis of 16S rDNA and ITS from strains

3 討論

自然界中存在著許多能產(chǎn)生纖維素酶的細菌真菌，在自然界纖維素的降解過程中發(fā)揮作用.目前用于生產(chǎn)纖維素酶的主要菌種大多為絲狀真菌以綠色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichodermareesei)和康氏木霉(Trichodermakoningii)為代表[28].纖維素酶是1個動態(tài)變化的多酶體系，在多重酶組成的體系內(nèi)，不同酶之間，同種酶在不同的發(fā)酵時間內(nèi)的酶活性很不一致.Liu等[29]將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)誘導突變選育的菌株JUA10-1發(fā)酵預處理的玉米芯和麩皮生產(chǎn)乙醇的研究中，濾紙酶活達到了8.21 IU.陳靜[30]篩選的菌株LY4-5的羧甲基纖維素酶活(CMCase)和濾紙酶活(FPA)分別為41.25、27.63 μg/mL遠低于本試驗篩選的2株菌，但濾紙失重率達到44.96%.與本試驗篩選的2株菌酶活和濾紙降解率差異較顯著.

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的選用、發(fā)酵溫度、測定波長的選擇、酶液量等都對酶活測定結(jié)果有一定的影響[31].而溫度是酶活測定的重要影響因素之一，溫度過高或過低都對酶活測定結(jié)果造成影響[32].曾思泉等[33]從紅樹林區(qū)分離出的纖維素降解真菌SCSIO43503與本試驗分離的菌株Z-3同屬枝孢屬(Cladosporium)，28 ℃培養(yǎng)后，在pH 5.0時3 d的酶活力最高可達到23.46 IU，高于本試驗菌株Z-3在50 ℃培養(yǎng)，3 d時于50 ℃、pH 4.5下反應測得的酶活力，但培養(yǎng)溫度遠低于本試驗.靳然[34]從土壤環(huán)境中分離的枝孢菌Bio-3(CladosporiumBio-1)也在28 ℃下培養(yǎng)，8 d內(nèi)的胞內(nèi)纖維素酶內(nèi)切葡聚糖酶最高酶活為2.9 IU/mL，由于培養(yǎng)溫度遠低于本試驗培養(yǎng)溫度，所測得酶活力差異較大.說明這類菌株具有夠較好溫度適應性，且能在高溫下產(chǎn)纖維素酶，但產(chǎn)酶量較常溫低.

圖9 菌株X-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 9 Phylogenetic tree of strain X-1

圖10 菌株Z-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 10 Phylogenetic tree of strain Z-3

國內(nèi)芽孢桿菌(Bacillales)在纖維素降解方面的研究較多[20，35-37]，而主要集中在高溫方面.張楠等[20]從牛糞堆肥中篩選出6株高溫纖維素降解細菌，其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在50 ℃下培養(yǎng)接種16 h后羧甲基纖維素酶活(CMCase)達到最高1.21 mg/mL(30 min)，和本試驗最高酶活相近，試驗篩選的部分菌株能夠在3 d內(nèi)將濾紙完全崩解，略高于本試驗結(jié)果.王海濱等[38]在45 ℃下篩選的耐高溫菌G-13能在5 d內(nèi)將濾紙完全崩解，與菌株Z-3對濾紙完全崩解的時間一致.Liang等[39]從豬糞中分離出的菌株在補充了微晶纖維素和CMC的培養(yǎng)基中，57 ℃條件下產(chǎn)生的纖維素酶基礎水平FPU為0.02 IU/mL，表明短桿菌屬(Brevibacillus)可能具有可降解纖維素的功能.伯氏短桿菌(Brevibacillusborstelensis)同為短桿菌屬，且能夠在高溫條件下降解纖維素，在纖維素降解方面的有待進一步深入研究.

4 結(jié)論

50 ℃的培養(yǎng)條件下通過富集培養(yǎng)、剛果紅水解圈篩選出的5株菌，X-1和Z-3對濾紙的降解效果最好，在7 d內(nèi)能夠?qū)V紙完全崩解，在7 d時的降解率分別為16.37%和18.86%.經(jīng)過菌落形態(tài)觀察和分子鑒定X-1為伯氏短桿菌(Brevibacillusborstelensis)，Z-3為枝孢菌屬(Cladosporium).篩選的這2株高溫降解菌在培養(yǎng)基上50 ℃恒溫培養(yǎng)經(jīng)過多次純化后生長較好，降解纖維素能力較強.且菌株X-1在纖維素降解方面研究較少，具有一定的研究價值.