李春艷，白曉慧，劉義，張振國(guó)，張麗， 劉克明，郝爽，羅璋，尤宏?duì)?/p>

(1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221； 2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402)

凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei，又名南美白對(duì)蝦、萬氏對(duì)蝦、白對(duì)蝦，隸屬于對(duì)蝦科Penaeidae對(duì)蝦屬Penaeus白對(duì)蝦亞屬Litopenaeus，原產(chǎn)于中、南美洲太平洋沿岸的溫暖水域，與斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦并列為世界三大養(yǎng)殖蝦類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年中國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)167.2萬t，占中國(guó)蝦類總產(chǎn)量的48%[1]，是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)品種之一。近幾年來，隨著高密度養(yǎng)殖及生態(tài)環(huán)境惡化，對(duì)蝦疾病頻繁暴發(fā)，這給越南、中國(guó)、馬來西亞等諸多國(guó)家的對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。

急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)，又稱“早期死亡綜合征”、“偷死綜合征”，一些致病性弧菌通?？梢鹪摬〉陌l(fā)生，這類弧菌通常攜帶能夠編碼獨(dú)立蛋白PIRVP的質(zhì)粒。據(jù)報(bào)道，副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus[4-5]、哈維氏弧菌Vibrioharveyi[6]、歐文斯弧菌Vibrioowensii[7]和坎貝氏弧菌Vibriocampbellii[8]均可引起對(duì)蝦AHPND。這些致病菌所攜帶的致病毒素(pirtoxins)均可引起肝胰腺等組織損壞，造成肝功能紊亂及消化系統(tǒng)障礙[9]。2014年以來，AHPND已成為天津地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中5種主要病害之一，已引起凡納濱對(duì)蝦大量死亡，對(duì)天津市對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[10]。

2017年6月，天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)大規(guī)模急性死亡，為分析天津地區(qū)凡納濱對(duì)蝦大規(guī)模死亡的原因，本研究團(tuán)隊(duì)及時(shí)采集發(fā)病對(duì)蝦，對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，利用人工感染試驗(yàn)確定分離株的致病性，并研究了病原菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶活力的影響，旨在為探討副溶血弧菌的致病性及對(duì)蝦AHPND的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用患病凡納濱對(duì)蝦取自天津市濱海新區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為5～6 cm，患病對(duì)蝦與AHPND臨床特征相似，表現(xiàn)為甲殼變軟、空腸空胃、肝胰腺顏色變淺。攻毒試驗(yàn)用健康對(duì)蝦取自天津市通洋農(nóng)業(yè)科技有限公司，室外池塘養(yǎng)殖，挑選體色正常、健康活潑、體表無損傷的凡納濱對(duì)蝦，體長(zhǎng)為(10.65 ±1.10)cm，體質(zhì)量為(12.18±3.74)g。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與培養(yǎng) 采集具有典型癥狀的病蝦帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)檢驗(yàn)。用75%的酒精棉球擦拭病蝦體表，在無菌條件下解剖病蝦，用無菌接種環(huán)蘸取肝胰腺樣品，劃線接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，菌株編號(hào)為VP0630。

1.2.2 菌株生化鑒定 利用梅里埃全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng) (VITEK2-compact) 對(duì)菌株VP0630進(jìn)行生理生化特性鑒定。挑取單菌落于0.85%無菌生理鹽水中打散，吸取100 μL的菌液涂布于15 g/L NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)18 h。刮取菌苔于0.85%無菌生理鹽水中，混合均勻制成菌懸液，并調(diào)節(jié)濃度至1.5×108CFU/mL，將調(diào)好的菌懸液加入生化分析儀進(jìn)行菌株鑒定。

1.2.3 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)提取菌株基因組DNA，并以此為模板，所用引物序列及退火溫度見表1。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序參考張振國(guó)等[11]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將VP0630菌株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知弧菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并利用MEGA 5.2軟件采用鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)檢驗(yàn)1000次。

1.2.4pir毒力基因檢測(cè) 根據(jù)AP4套式PCR方法[12]進(jìn)行pir毒力基因擴(kuò)增，所用引物序列及退火溫度見表1，PCR產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 副溶血弧菌鑒定所用引物

1.2.5 攻毒試驗(yàn) 將健康凡納濱對(duì)蝦于100 L的藍(lán)色水槽中暫養(yǎng)5 d，定期換水，鹽度為5～6，溶氧量>5 mg/L以上，pH為8～9，氨氮濃度和亞硝酸氮濃度分別控制在0.2、0.1 mg/L以下。采用澳華公司生產(chǎn)的全價(jià)配合飼料作為餌料(蛋白質(zhì)含量42%)，每日投餌2次。試驗(yàn)前對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行以下6種病原檢測(cè)：參照《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》對(duì)白斑綜合征病毒 (WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、桃拉病毒(TSV)進(jìn)行檢測(cè)[13]；參照相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌 (VPAHPND)[12]、蝦肝腸胞蟲 (EHP)[14]和偷死野田村病毒(CMNV)[15]進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為陰性后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

攻毒試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和感染組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾蝦。每組的兩個(gè)平行用于觀察對(duì)蝦死亡情況，一個(gè)平行用于檢測(cè)酶活力。用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，感染組注射3×107CFU/mL的副溶血弧菌，每尾蝦注射25 μL，注射部位為凡納濱對(duì)蝦的第5腹節(jié)肌肉處。對(duì)照組注射相同體積0.86%的無菌生理鹽水，攻毒期間不投餌，正常充氣。在注射后3、6、9、12、24、48、72、96 h分別取血液和肝胰腺樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取3尾瀕臨死亡對(duì)蝦樣品。連續(xù)觀察感染組和對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦的活力、發(fā)病及死亡情況，及時(shí)清除死蝦。

1.2.6 免疫酶活力檢測(cè) 用1 mL無菌注射器從對(duì)蝦圍心竇或腹血竇采集血淋巴，4 ℃下放置12 h(過夜)，析出血清后，以5000 r/min低溫離心10 min，吸取血清，于-20 ℃下保存，用于酶活力檢測(cè)。將肝胰腺用濾紙擦干，稱重，按照質(zhì)量與體積比為1∶10(g∶mL)加入預(yù)冷的生理鹽水，勻漿。將制備好的組織勻漿液以3000 r/min離心10 min，取上清于-80 ℃下保存?zhèn)溆?，用于肝胰腺酶活性的測(cè)定。溶菌酶(LYS)、堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)活力及總抗氧化能力(T-AOC)均采用上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。使用Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定96孔板各孔吸光度，具體方法按照說明書進(jìn)行。特定條件下1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物或者底物中1 μmol有關(guān)基團(tuán)所需的酶量，稱為一個(gè)酶活力國(guó)際單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

利用梅里埃全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行了47項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示，菌株VP0630鑒定為副溶血弧菌V.parahaemolyticus的概率為99%(表2)。

表2 菌株VP0630的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of VP0630 strain

PCR擴(kuò)增獲得菌株VP0630的16S rRNA基因片段大小為1446 bp(LC500889)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源比對(duì)。結(jié)果顯示，VP0630菌株的16S rRNA基因序列屬于弧菌屬。下載NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性較高的弧菌屬16S rRNA基因序列與VP0630的16S rRNA基因序列進(jìn)行多重比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，VP0630菌株與副溶血弧菌的親緣關(guān)系最近，與副溶血弧菌VibroparahaemolyticusNR_113604和NR_041838首先聚為一支，之后再與坎貝氏弧菌Vibriocampbellii、歐文斯弧菌Vibrioowensii和哈維氏弧菌Vibrioharveyi聚為一支(圖1)。結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，將菌株VP0630鑒定為副溶血弧菌。

圖1 基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

為研究菌株VP0630的致病性，利用AP4套式PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)一步開展毒力基因pir檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。套式PCR結(jié)果顯示,兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物均為陽性，表明菌株VP0630為致病性副溶血弧菌。

2.2 人工感染試驗(yàn)

利用菌株VP0630對(duì)健康凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示：感染組感染3 h后無明顯癥狀，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)死亡；24 h后感染組對(duì)蝦活力明顯減弱，死亡數(shù)量顯著增多，部分死亡對(duì)蝦出現(xiàn)空腸空胃，肝胰腺輕微糜爛，甲殼變軟，肌肉輕微渾濁等現(xiàn)象；對(duì)照組對(duì)蝦活力較好，雖有個(gè)別死亡，但無軟殼及肝胰腺糜爛的現(xiàn)象；凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌48 h時(shí)，感染組累積死亡率為46.40%，對(duì)照組死亡率為8.67%；96 h時(shí)感染組累積死亡率為78.37%，對(duì)照組的死亡率為8.67%，感染組死亡率比對(duì)照組高69.70%(圖3)。

圖3 注射副溶血弧菌后凡納濱對(duì)蝦的累積死亡率Fig.3 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei challenged with Vibrio parahaemolyticus

注:M為Marker;A為第一輪擴(kuò)增結(jié)果;B為第二輪擴(kuò)增結(jié)果Note：M,Marker;A，the first PCR amplification;B，the second PCR amplification圖2 VP0630菌株AP4 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 AP4 PCR amplification of VP0630 strain

2.3 血清中酶活力的變化

從表3可見：對(duì)照組血清中6種酶活力在3～96 h時(shí)無顯著性差異(P>0.05)，感染組6種酶活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；感染組LYS和T-AOC酶活力在12 h時(shí)達(dá)到最高， 96 h時(shí)酶活力降到最低且與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；感染組ALP酶活力在12 h時(shí)達(dá)到最高，72 h時(shí)酶活力降到最低且與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；感染組ACP酶活力在9 h時(shí)達(dá)到最高，96 h時(shí)降到最低且顯著低于對(duì)照組水平(P<0.05)；SOD和PO酶活力在6 h時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低，96 h時(shí)降到最低且與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

表3 注射副溶血弧菌后凡納濱對(duì)蝦血清中6種酶活力的變化

2.4 肝胰腺中酶活力的變化

從表4可見：對(duì)照組肝胰腺中6種酶活力在3～96 h時(shí)無顯著性差異(P>0.05)，感染副溶血弧菌后6種酶活力均呈先升高后降低的趨勢(shì)；感染組LYS和T-AOC酶活力在12 h時(shí)達(dá)到最高，之后顯著降低(P<0.05)，96 h時(shí)降低到最低水平；感染組ALP酶活力在12 h時(shí)達(dá)到最高，72 h時(shí)降到最低且與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；感染組ACP酶活力在6 h時(shí)達(dá)到最高，72 h時(shí)酶活力降到最低且與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；感染組SOD酶活力在6 h時(shí)急劇上升到最高水平，之后波動(dòng)式降低，96 h時(shí)酶活力降低到最低且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；感染組PO酶活力在6 h時(shí)達(dá)到最高，9 h時(shí)迅速降低到對(duì)照組水平，24 h后酶活力顯著低于對(duì)照組水平(P<0.05)。

表4 注射副溶血弧菌后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中6種酶活力的變化

3 討論

3.1 副溶血弧菌的分離鑒定

副溶血弧菌廣泛分布于海洋、河口及海灣，可導(dǎo)致多種動(dòng)物發(fā)病，在養(yǎng)殖的魚類[16]、貝類[17-18]、甲殼類[2, 19]中均有副溶血弧菌感染致病的報(bào)道。副溶血弧菌在中國(guó)海產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品中具有較高的檢出率，是引起細(xì)菌性食物中毒的首要致病菌[20]。從地域分析，天津地區(qū)海產(chǎn)品副溶血弧菌檢出率較高，攜帶毒力基因的菌株檢出率可達(dá)52%[21]。本課題組從發(fā)病對(duì)蝦肝胰腺分離得到菌株VP0630，通過梅里埃全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定，將菌株鑒定為副溶血弧菌。通過AP4套式PCR法確認(rèn)該菌株含有pir毒力基因，為致病性副溶血弧菌。該研究豐富了致病性副溶血弧菌及AHPND疾病的研究資料。

3.2 副溶血弧菌的致病性

攻毒試驗(yàn)表明，VP0630菌株具有較強(qiáng)的致病力，感染組對(duì)蝦96 h累積死亡率為78.37%，死亡對(duì)蝦出現(xiàn)空腸空胃、肝胰腺輕微糜爛、甲殼變軟及肌肉輕微渾濁等癥狀，與AHPND典型癥狀相似。有研究表明，體質(zhì)量為2.20 g的凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌后，24 h累積存活率為44%[4]。體長(zhǎng)為3 cm的凡納濱對(duì)蝦在注射1×107CFU/mL的副溶血弧菌液24 h后，累積死亡率高達(dá)90%以上[2]。本研究中凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌24 h后累積死亡率為29.96%，這可能是因試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦規(guī)格較大(10.65 cm)，具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力，故死亡率和死亡時(shí)間與上述研究有所差異。本研究中，感染組對(duì)蝦96 h累積死亡率達(dá)到78.37%，比對(duì)照組高出69.70%，說明菌株VP0630對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有較強(qiáng)的致病力。由此可見，副溶血弧菌不僅僅對(duì)于幼蝦(3～5 cm)具有致病力，對(duì)于規(guī)格較大的對(duì)蝦也具有較強(qiáng)的致病力。

3.3 副溶血弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶活力的影響

甲殼動(dòng)物免疫功能通過血淋巴中一些非特異性酶類和活性因子來發(fā)揮，其血淋巴中溶菌酶(LYS)、酚氧化酶(PO)、堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)等酶類均為非特異性免疫因子，可以抵御病原體的侵害。斑節(jié)對(duì)蝦感染鰻弧菌后，肝胰腺和鰓中的LYS活性分別于6、12 h時(shí)達(dá)到最高值[22]。墨吉明對(duì)蝦感染副溶血弧菌和溶藻弧菌后，LYS基因mRNA表達(dá)量持續(xù)升高，分別于24、12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，且感染組顯著高于對(duì)照組[23]。健康中國(guó)對(duì)蝦血清中PO活性相對(duì)穩(wěn)定，機(jī)體受到大量病原體侵害時(shí)，proPO轉(zhuǎn)化為PO，PO活性短時(shí)間內(nèi)急劇升高[24]。羅氏沼蝦感染溶藻弧菌后，ALP和ACP活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)[25]。而患病中國(guó)對(duì)蝦的ALP和ACP陽性反應(yīng)較健康對(duì)蝦增多，且這些反應(yīng)與透明細(xì)胞的吞噬作用相關(guān)[26]。日本蟳在感染溶藻弧菌后，肝胰腺中SOD活性在6～12 h時(shí)顯著上升，隨后呈下降趨勢(shì)[27]。副溶血弧菌感染凡納濱對(duì)蝦后，肝胰腺中SOD活性顯著高于對(duì)照組，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)活性降低[4]。斑節(jié)對(duì)蝦感染副溶血弧菌后，肝胰腺和鰓中的T-AOC活性分別于12 h和6 h時(shí)達(dá)到最高，48 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平[28]。

本研究中，凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌后，血清和肝胰腺中LYS、PO、SOD、ALP、ACP、T-AOC酶活性均在6～12 h顯著升高，與上述研究中酶活力的變化趨勢(shì)一致。這可能是副溶血弧菌誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦發(fā)生非特異性免疫反應(yīng)，合成大量抗菌蛋白和溶菌蛋白，用于清除入侵的副溶血弧菌，使得LYS活性升高。同時(shí)，副溶血弧菌的感染激活了凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的proPO活性，短時(shí)間內(nèi)(6 h)PO的活力顯著提高，進(jìn)而形成黑色素及誘導(dǎo)其他免疫功能以達(dá)到殺滅病原體的目的[29]。副溶血弧菌數(shù)量的驟然增加誘發(fā)細(xì)胞吞噬和包裹作用，使得血清和肝胰腺ALP和ACP活性顯著升高。細(xì)胞吞噬和包裹作用發(fā)生時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放大量的ROS，SOD作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分被大量合成，用來清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基，使得SOD活性在6 h內(nèi)顯著升高。作為機(jī)體抗氧化能力綜合指標(biāo)的T-AOC活性在6～12 h內(nèi)也顯著升高。而隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，副溶血弧菌在體內(nèi)大量繁殖，高濃度的病原菌可能會(huì)破壞機(jī)體正常的細(xì)胞功能，細(xì)胞吞噬和包裹作用受到破壞，抑制proPO激活系統(tǒng)，同時(shí)降低機(jī)體抗氧化防御能力，使得LYS、PO、SOD、ALP、ACP、T-AOC活力降低，故本研究中大部分酶活性感染后72～96 h時(shí)降低至對(duì)照組水平，僅個(gè)別酶活力顯著低于對(duì)照組。