趙小然，郭羿，黨慧鳳，邢震宇，何哲，葉仕根

(大連海洋大學 農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

哈維氏弧菌Vibrioharveyi是一種具有運動性的革蘭氏陰性菌，是弧菌病的主要病原菌之一，廣泛分布于海洋及河口水生生態(tài)系統(tǒng)中[1]?；【∈侨驅ξr和貝類養(yǎng)殖業(yè)中面臨的最普遍、最嚴重的威脅之一，哈維氏弧菌感染可導致蝦肝胰腺細胞壞死和肝胰腺小管萎縮，其胞外產物可導致雙殼類幼蟲活動能力降低、游動不規(guī)律、瓣膜關閉和面盤脫離[2-3]。隨著中國水產養(yǎng)殖品種的增多，該病原菌感染的宿主范圍也在逐漸擴大，包括半滑舌鰨CynoglossussemilaevisGunther、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides、紅鰭東方鲀Takifugurubripes等經濟魚類品種[1,4-5]，細菌數(shù)量超過閾值就會大面積暴發(fā)弧菌病，臨床癥狀表現(xiàn)為出血性敗血癥、腸炎和眼部病變等，死亡率較高，該病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[6-7]。

與其他革蘭氏陰性菌相似，哈維氏弧菌通過多種表面蛋白和毒力因子感染宿主細胞，包括磷脂酶C(PLC)、溶血素(hemolysin)、脂多糖(lipopolysaccharide)、黏附相關因子(adhesion factors)等[8]。其中，哈維氏弧菌溶血素(Vibrioharveyihemolysin,VHH)作為哈維氏弧菌的主要毒力因子，是熱不穩(wěn)定性溶血素(thermolabile hemolysin，TLH)家族的成員之一，具有磷脂酶A2或溶血磷脂酶活性，能溶解細胞膜，進而促進細菌進入宿主細胞[9]，在哈維氏弧菌致病過程中起到關鍵作用。Zhang等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌的致病性與溶血素密切相關，且致病力最強的VIB645菌株含有兩個溶血素(vhhA和vhhB)基因，其他致病菌株只有一個溶血素基因，而vhh缺失株則幾乎無致病力。經驗證，153號絲氨酸(Ser)是VHH活性的關鍵氨基酸殘基之一，將其突變?yōu)闊o催化作用的甘氨酸(Gly)殘基，得到的VHH突變蛋白失去了磷脂酶活性、溶血活性和對大菱鲆的致病性[12]。目前，溶血素已在大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、李斯特菌Listeriamonocytogenes、弧菌屬Vibriosp.[13-16]等多個種屬中發(fā)現(xiàn)，與細菌定植和免疫逃避相關，在病原菌致病機制中發(fā)揮重要作用。

本研究中，成功構建原核表達載體pET28a-vhh，并進行了VHH包涵體蛋白的重組表達及鼠源多克隆抗體的制備，驗證了多抗的效價和活性，為完善哈維氏弧菌檢測方法、制備VHH單抗和疫苗及進一步開展相關科研工作提供了基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用哈維氏弧菌(No.2 HWH020)取自大連市海珍品疾病防控重點實驗室。試驗用6～8周齡BALB/c雌性小白鼠，購于大連醫(yī)科大學SPF試驗動物中心。

Taq擴增體系、DNA標準Marker、克隆載體pMD19-T、表達載體pET28a購于TaKaRa公司；限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4連接酶、Prestained Protein Ladder PageRuler購于Thermo公司；質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技有限公司；His·Tag單克隆抗體、氨芐西林(Amp)、硫酸卡那霉素(Kan)、尿素、IPTG、Ni-NTA親和層析柱購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Triton X-100、PVDF膜、超濾離心管、NBT/BCIP顯色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；感受態(tài)細胞DH5、BL21(DE3)購于北京全式金生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、AP標記的羊抗鼠IgG購于Sigma公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體pET28a-vhh的構建 根據(jù)NCBI中vhhA的基因序列(GenBank AF293430)設計引物vhh-F和vhh-R，引物序列見表1。以哈維氏弧菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經DNA純化回收試劑盒進行回收。將回收產物與pMD19-T連接并轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性菌落，再以M13-F/R為引物進行PCR驗證并測序，獲得重組克隆載體pMD19-T-vhh。提取質粒pMD19-T-vhh和pET28a，使用XhoI和BamHⅠ分別進行雙酶切，酶切產物經T4連接酶連接后轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性菌落，以T7-F/R為引物進行PCR驗證并測序，獲得重組表達載體pET28a-vhh。

表1 本試驗所用引物Tab.1 Primers used in present experiment

1.2.2 重組包涵體蛋白的誘導表達及純化 提取質粒pET28a-vhh，并轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，于LB肉湯培養(yǎng)基中37 ℃下以180 r/min活化1 h，涂布于含有Kan抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃下過夜培養(yǎng)。挑取單克隆接種于含有Kan抗性的LB肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600 nm=0.70，加入終濃度為1 mmol/L 的 IPTG 于16 ℃下以180 r/min誘導12 h。誘導結束后離心并收集菌體，用PBS緩沖液重懸，在冰浴條件下進行超聲波破碎，離心分別收集上清、包涵體，進行SDS-PAGE分析。

經SDS-PAGE檢測后進行Western-blot分析。將PAGE膠上的樣品電轉移至PVDF膜上，用質量分數(shù)為5%的脫脂奶粉在4 ℃下封閉過夜。再將膜置于His·Tag單克隆抗體(用5%脫脂奶粉按1∶2000稀釋)中，室溫孵育1.5 h，先用PBST洗滌，再用PBS清洗兩遍。將PVDF膜置于堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗鼠IgG二抗(用5%脫脂奶粉按1∶3000稀釋)中，室溫孵育1.5 h，經PBST、PBS洗滌后，加入配制的新鮮NBT/BCIP顯色液，顯色10 min，觀察結果。

將包涵體置于8 mol/L尿素緩沖液中溶解過夜。次日，離心收集上清(粗蛋白)，用0.22 μm濾膜過濾后，上樣于Ni-NTA親和層析柱，用梯度咪唑緩沖液(10、20、30、40、50、80、100、200、500 mmol/L)洗脫并分別收集洗脫液進行SDS-PAGE分析。將純化后的蛋白進行復性，并使用截留相對分子質量30 000的超濾離心管進行蛋白濃縮和脫咪唑，測定濃度后分裝，于-80 ℃下保存。取部分濃縮后的蛋白置于4 ℃下保存，每天取50 μL樣品與上樣緩沖Buffer混合，14 d后通過SDS-PAGE檢測蛋白穩(wěn)定性。

1.2.3 多克隆抗體的制備與效價檢測 取上述重組蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1混合、乳化，取200 μL給每只免疫小鼠皮下注射(共3只)；兩周后取同樣劑量的純化蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，進行第二次免疫；之后每隔7 d采用同樣的方法進行第三、四次免疫。第四次免疫后7 d注射原抗原以加強免疫。于加強免疫后的第3天從小鼠眼眶取血，收集血清并分裝，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用DOT-ELISA方法測定血清效價。將純化所得的VHH蛋白作為抗原包被膜片，用5%脫脂奶粉4 ℃下封閉過夜。將血清按1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10 240、1∶20 480、1∶40 960、1∶81 920、1∶163 840、1∶327 680比例進行稀釋，加入酶標板中，37 ℃下孵育1 h。經洗滌，加入AP標記的羊抗鼠IgG二抗(用5%脫脂奶粉按1∶3000稀釋)，37 ℃下孵育1 h。清洗后加入NBT/BCIP底物顯色液，待呈現(xiàn)明顯的藍紫色斑點時，用蒸餾水終止反應，待干燥后拍照記錄。

1.2.4 多克隆抗體的活性驗證 通過DOT-ELISA確定多克隆抗體的最高效價，以該抗體為一抗，用Western-blot檢測VHH蛋白，以確定多抗的特異性，方法同“1.2.3”節(jié)。

將過夜培養(yǎng)的哈維氏弧菌菌液于4 ℃下以10 000 r/min離心1 min，獲得培養(yǎng)上清液。取50 μL菌液上清與15 μL魚脫纖維紅細胞、1 μL不同稀釋倍數(shù)的多抗和PBS緩沖液混合至終體積為500 μL?；旌象w系于28 ℃下孵育4 h，離心去除紅細胞，通過測定上清液的OD543nm值以評估自制多抗體外抑制哈維氏弧菌溶血活性的作用。以1% Triton X-100處理組為陽性對照，無多抗組為空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值和標準差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析和P值計算，組間差異分析采用獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體pET28a-vhh的構建

以哈維氏弧菌DNA為模板，以vhh-F/R為引物進行PCR擴增。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在1257 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1-A)。將目的片段與pMD19-T連接并轉化至DH5α中，以M13-F/R為引物經PCR驗證為陽性(圖1-B)。測序結果經Blast比對，與vhhA(GenBank AF293430)序列的一致性為99%。重組克隆載體經雙酶切后，回收目的片段vhh并與pET28a連接，以T7-F/R為引物經PCR驗證為陽性(圖1-C)。經測序驗證正確，證明重組表達載體構建成功，命名為pET28a-vhh。

注：A為vhh基因擴增結果，1為vhh基因；B為質粒pMD19-T-vhh的鑒定結果，2～4均以M13-F/R為引物的擴增結果，5為質粒pMD19-T-vhh；C為質粒pET28a-vhh的鑒定結果，6～8均以T7-F/R為引物的擴增結果，9為質粒pET28a-vhh；M為DNA MarkerNote: A, amplification of vhh gene, 1, the vhh gene; B, identification of plasmid pMD19-T-vhh, 2-4, amplification of M13-F/R as primer, 5, plasmid pMD19-T-vhh; C, identification of plasmid pET28a-vhh, 6-8, amplification of T7-F/R as primer, 9, plasmid pET28a-vhh; M, DNA Marker圖1 重組表達載體pET28a-vhh的構建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pET28a-vhh

2.2 包涵體蛋白的表達與純化

提取質粒pET28a-vhh并轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，加入1 mmol/L IPTG于16 ℃下過夜誘導表達，超聲波破碎后進行SDS-PAGE分析。結果顯示，在相對分子質量約47 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖2-A)，與預期大小一致，在該誘導條件下重組蛋白以包涵體形式存在。以His標簽抗體為一抗，以AP標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行Western-blot分析，成功檢測到9、10泳道樣品中的重組蛋白(圖2-B)，進一步證明了VHH蛋白已成功表達；8泳道樣品BL21(DE3)未檢測到條帶，故圖2-A中1泳道約47 000處為雜蛋白，而非目的蛋白。

梯度洗脫收集的樣品經SDS-PAGE電泳檢測，在相對分子質量47 000處出現(xiàn)目的條帶(圖2-C)，可觀察到200 mmol/L咪唑洗脫液中的目的蛋白含量最大，且雜蛋白最少。將濃縮后的蛋白置于4 ℃，14 d內連續(xù)取樣以測定蛋白的穩(wěn)定性,結果如圖2-D所示，隨著時間延長，蛋白相對分子質量由47 000下降至約34 000，說明該蛋白穩(wěn)定性差易降解，為保證抗原的均一性，在多克隆抗體的制備過程中需使用新鮮純化的蛋白進行免疫。

注：A為pET28a-vhh-BL21(DE3)的誘導表達結果，1為BL21(DE3)，2、3分別為未誘導和誘導的pET28a-BL21(DE3)，4為未誘導的pET28a-vhh-BL21(DE3)，5～7分別為誘導的pET28a-vhh-BL21(DE3)全菌、上清、沉淀；B為His抗體檢測結果，8為BL21(DE3)，9～10分別為誘導的pET28a-vhh-BL21(DE3)全菌、沉淀；C為蛋白純化結果，1～19分別為10、20、30、40、50、80、100、200、500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫蛋白的洗脫液；D為蛋白穩(wěn)定性檢測結果，20～28分別為原蛋白和置于4 ℃后1～7、14 d的蛋白樣品；M為蛋白MarkerNote: A, induced expression of pET28a-vhh-BL21(DE3), 1, BL21(DE3), 2 and 3, uninduced and induced pET28a-BL21(DE3), respectively, 4, uninduced pET28a-vhh-BL21(DE3), 5-7, whole bacteria, supernatant, and precipitation of induced pET28a-vhh-BL21(DE3), respectively; B, the detection of His antibody, 8, BL21(DE3), 9 and 10, whole bacteria and precipitation of induced pET28a-vhh-BL21(DE3), respectively; C, protein purification, 11-19, the eluent of protein eluted by 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 200, and 500 mmol/L imidazole buffer; D, protein stability detection,20-28, the original protein and sample protein after 1 to 7 d, and 14 d at 4 ℃, respectively; M, protein Marker圖2 重組蛋白的表達與純化Fig.2 Expression and purification of recombinant protein

2.3 多克隆抗體的效價檢測

利用Nanodrop微量核酸蛋白濃度測定儀測得濃縮后的蛋白濃度為6.27 mg/mL。通過DOT-ELISA測得3只小鼠血清中多克隆抗體的效價分別為1∶81 920、1∶163 840、1∶163 840(圖3-A)。取效價最高的多克隆抗體為一抗，以AP磷酸酶標記的羊抗鼠抗體為二抗，對VHH蛋白、哈維氏弧菌培養(yǎng)上清液及誘導后的pET28a-vhh-BL21(DE3)菌液進行Western-blot檢測，在相對分子質量約47 000處均能檢測到大小相同的條帶，結果表明，該多克隆抗體特異性良好(圖3-B)。

2.4 多克隆抗體的活性驗證

從圖3-C可以看出，隨著多抗稀釋倍數(shù)的升高，上清液顏色變深，即體系中裂解的紅細胞數(shù)量增多。測定各組樣品OD543nm結果如圖3-D所示，無多抗組的紅細胞裂解率為97.49%，在混合體系中加入未稀釋和稀釋10、100、500、1000倍的多抗時，紅細胞裂解率分別為9.70%、20.80%、42.80%、47.96%和97.10%。溶血試驗結果表明，將VHH多抗稀釋500倍時，對哈維氏弧菌體外溶血活性仍具有顯著的抑制作用，即對VHH介導的魚紅細胞裂解起到保護作用。

3 討論

3.1 VHH重組蛋白的表達與純化

大腸桿菌是外源基因表達系統(tǒng)中最好的一種[17]，且pET系統(tǒng)是目前在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白方面最強大的系統(tǒng)[18]。本試驗中構建了pET28a-vhh重組表達載體，并將其轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行蛋白表達，在前期的試驗中，對誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度進行了摸索，以篩選出VHH蛋白表達的最優(yōu)條件。結果表明，誘導溫度為16 ℃、誘導時間為12 h、IPTG濃度為1 mmol/L的條件下，重組蛋白的表達量最高，經SDS-PAGE電泳顯示，VHH蛋白以包涵體形式高效表達。鐘英斌[19]在關于vhh基因原核表達的研究中所用的表達載體是pET24d，表達菌株經IPTG于25 ℃下誘導6 h，與本研究中所采用的表達載體和誘導條件不同，故在重組蛋白的存在形式及表達量方面存在較大差異。

鐘英斌[19]在上清中純化得到的VHH蛋白相對分子質量大小為45 600，與本次試驗從包涵體中純化得到的蛋白相差2100，這可能是由于VHH蛋白N末端的20個氨基酸構成信號肽，蛋白分泌到胞外時信號肽被切除，故從上清中純化得到的可溶性蛋白相對分子質量較小。與可溶性蛋白相比較，包涵體蛋白純度更高，且包涵體表達可以有效避免蛋白酶對外源蛋白的降解。

注：A為多抗效價檢測結果；B為多抗特異性檢測結果，1～3分別為VHH蛋白、哈維氏弧菌培養(yǎng)上清、誘導后的pET28a-vhh-BL21(DE3)菌液；C和D為多抗與哈維氏弧菌培養(yǎng)上清的溶血試驗結果(與無多抗組相比，*表示P<0.05,**表示 P<0.01)；M為蛋白MarkerNote: A, detection of polyclonal antibody titer; B, detection of polyclonal antibody specificity, 1-3, VHH protein, V.harveyi culture supernatant, and induced pET28a-vhh-BL21(DE3), respectively; C and D, hemolytic test results of polyclonal antibody and V.harveyi culture supernatant(compared with the group without polyclonal antibody, *, P<0.05；**, P<0.01); M, protein Marker圖3 多克隆抗體的效價及活性檢測Fig.3 Titer and activity detection of polyclonal antibodies

3.2 包涵體蛋白的變性和復性

包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒[20]。本研究中，因大腸桿菌BL21(DE3)表達效率高，蛋白合成速度過快，以至于無足夠的時間進行折疊，蛋白間非特異性結合過多，無法達到足夠的溶解度，導致VHH蛋白以包涵體形式存在[21]。

純化包涵體蛋白之前，需將包涵體溶解于高濃度尿素緩沖液(8 mol/L)中，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵使之變性，進而增加蛋白可溶性。純化后進行蛋白復性，通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結構[22]。常見的復性方法有稀釋、透析和超濾。稀釋復性法是向蛋白中直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制；超濾復性法在生產中使用較多，不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中發(fā)生不可逆的變性；本試驗中采用的是透析復性法，透析袋中的蛋白樣品與外透液進行離子交換，通過逐漸降低外透液濃度來去除蛋白樣品中的變性劑，進而達到復性的目的。

3.3 VHH多克隆抗體的制備

多克隆抗體是應用于免疫防治、基礎研究中的常見手段之一。為獲得高質量的多抗，理論上應使用同一批次的抗原免疫小鼠，但由于重組VHH蛋白穩(wěn)定性較差，故需使用新鮮制備的蛋白進行免疫，為彌補這一不足，本研究中將4次免疫的蛋白終濃度均調整為50 μg/mL，并進行一次加強免疫。DOT-ELISA和Western-blot結果表明，采用本方法制備的VHH多抗效價高達1∶163 840，均可識別重組蛋白和天然蛋白且特異性高。對該多抗活性檢測發(fā)現(xiàn)，自制的多抗對哈維氏弧菌溶血活性的體外抑制效果良好。本研究結果對VHH單抗的制備、哈維氏弧菌檢測手段的完善、哈維氏弧菌的疫苗研發(fā)及相關科研工作的開展均具有一定參考價值。