林洪斌，方佳興，畢小朋，周彬彬，劉平，丁文武，車振明

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

郫縣豆瓣是中國(guó)四川地區(qū)一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，主要原料為紅辣椒和蠶豆，加上面粉和食用鹽等輔料發(fā)酵而成，具有味辣香醇、紅棕油亮、醬香濃郁等特點(diǎn)，被譽(yù)為“川菜之魂”[1]。特殊的釀造工藝、原料及環(huán)境因素造就了郫縣豆瓣獨(dú)特的風(fēng)味，郫縣豆瓣生產(chǎn)工藝主要分前發(fā)酵及后發(fā)酵2個(gè)階段，前發(fā)酵階段主要包括蠶豆瓣的制曲(下文稱曲瓣子)、甜瓣子的發(fā)酵及辣椒醅的預(yù)處理，其中甜瓣子是接種米曲霉制曲后的蠶豆瓣輔以一定比例鹽水混合發(fā)酵而成的郫縣豆瓣半成品；后發(fā)酵階段主要將成熟甜瓣子與辣椒醅按比例混合，在工業(yè)條池或陶缸中，通過特殊的“翻、曬、露”生產(chǎn)工藝及陳化，最終得到風(fēng)味獨(dú)特的郫縣豆瓣成品[2-3]。甜瓣子發(fā)酵階段利用制曲階段積累的蛋白酶、淀粉酶等酶系對(duì)原料中大分子物質(zhì)進(jìn)行分解，產(chǎn)生多肽、氨基酸、糖、有機(jī)酸和各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，郫縣豆瓣前發(fā)酵階段是風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段[4-6]。而蛋白質(zhì)是發(fā)酵調(diào)味品中風(fēng)味物質(zhì)的重要來源，蛋白質(zhì)逐步水解釋放出的呈味肽及游離氨基酸等小分子物質(zhì)賦予了調(diào)味品獨(dú)特的滋味[7-8]，同時(shí)部分氨基酸是許多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的前體物質(zhì)。廖順等[9]從白腐乳中分離出3條肽鏈，其中2條分別呈鮮味和鮮酸味，另1條在味精溶液中呈現(xiàn)明顯增鮮作用。林洪斌等[4]對(duì)后發(fā)酵階段郫縣豆瓣氨基酸呈味效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，認(rèn)為谷氨酸是郫縣豆瓣鮮味的主要來源，氨基酸進(jìn)一步降解形成乙醛、乙醇和酯類等小分子揮發(fā)性香氣物質(zhì)[10]。近年來，研究人員在提高郫縣豆瓣蛋白利用率等方面做了較多研究，主要集中在篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株、提高成曲酶活力、優(yōu)化生產(chǎn)工藝等方面。陳廷廷等[11]通過米曲霉與黑曲霉共培養(yǎng)復(fù)合制曲提高成曲中蛋白酶活力，比單一菌株發(fā)酵酶活力提升1倍。李由[12]通過優(yōu)化蛋白水解工藝條件來提高氨基酸態(tài)氮含量，但關(guān)于郫縣豆瓣中蛋白質(zhì)組成及降解變化規(guī)律的研究卻鮮見報(bào)道。

本研究從郫縣豆瓣分級(jí)蛋白組分出發(fā)，根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性，采用Osborne分級(jí)提取法對(duì)郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，分析各組分蛋白在甜瓣子階段降解變化規(guī)律及多肽、游離氨基酸等降解產(chǎn)物變化情況，為改進(jìn)郫縣豆瓣生產(chǎn)工藝，指導(dǎo)曲料酶系構(gòu)建，提高蛋白質(zhì)利用率，提升產(chǎn)品風(fēng)味提供理論依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料取自成都市旺豐食品有限公司生產(chǎn)車間，取制曲0、3、7 d曲瓣子及鹽水發(fā)酵15、30、45、60、90 d的甜瓣子，其中m(曲瓣子)∶m(食鹽)∶m(水)=100∶38∶75，分別編號(hào)Q0、Q3、Q7、T15、T30、T45、T60、T90，樣品經(jīng)冷凍干燥后粉碎，過40目篩備用。

乙醇、NaOH、三氯乙酸、NaCl、濃H2SO4、CuSO4、硼酸、HCl、十二烷基硫酸鈉、甘油、三羥甲基氨基甲烷,分析純,成都科龍化工廠；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250,上海源葉生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京金克隆生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KH3200E超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TD-5M型離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；日立L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；MVS-1旋渦混合器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Spectra Max i3x型多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器 (上海) 有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司; DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總蛋白含量測(cè)定

自動(dòng)凱氏定氮儀法，參照GB 5009.5—2010。

1.3.2 Osbrone法分級(jí)蛋白提取工藝

水溶蛋白提取[13]：稱取5 g樣品，以蒸餾水為提取劑，加入50 mL蒸餾水于40 ℃下浸提1 h，8 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液；沉淀用蒸餾水沖洗3次，所得上清液與第1次上清液混合，定容至100 mL，即得水溶蛋白溶液。

鹽溶蛋白提?。喝〉谝徊讲僮魉贸恋?，以5% NaCl溶液為提取劑，參照第一步工藝條件，收集上清液，即得鹽溶蛋白溶液。

醇溶蛋白提取：取第一步操作所得沉淀，以75 %乙醇溶液為提取劑，參照第一步工藝條件，收集上清液，即得醇溶蛋白溶液。

麥谷蛋白提?。喝〉谝徊讲僮魉贸恋?，以0.1 mol/L NaOH溶液為提取劑，參照第一步工藝條件，收集上清液，即得麥谷蛋白溶液。

1.3.3 各組分蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Boardford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[14]。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，595 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，得到牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.006 1X+0.015 6(R2=0.998 9)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好線性關(guān)系。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

提取的蛋白溶液，各自加不同比例緩沖溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蛋白溶液，加入等量5×上樣緩沖液(內(nèi)含100 g/L SDS、5 g/L溴酚藍(lán)、體積分?jǐn)?shù)的50%甘油、5%巰基乙醇、0.25 mol/L pH 6.8 Tris-HCl)，沸水浴中加熱5 min。配制質(zhì)量濃度為120 g/L分離膠和50 g/L的濃縮膠，上樣量10 μL，開始電壓80 V，進(jìn)入分離膠后電壓120 V，條帶至分離膠底端后電泳結(jié)束，經(jīng)考馬斯R250溶液染色后脫色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 多肽含量測(cè)定

參考夏蓉等[15]的方法。稱取2 g樣品放入研缽研磨粉碎，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.8)定容至10 mL，4 ℃浸提1 h，8 000 r/min離心15 min取上清液。上清液與等體積15%(體積分?jǐn)?shù))三氯乙酸混合均勻后4 ℃靜置30 min，8 000 r/min離心15 min以去除大分子蛋白質(zhì)，取上清液為肽提取液，參照1.3.3方法測(cè)定多肽含量。

1.3.6 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定游離氨基酸含量

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 30987—2014，配制20種游離氨基酸，濃度為1.25 μmol/mL，作為母液。

流動(dòng)相的配制：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 30987—2014中相關(guān)要求配制流動(dòng)相B1-6及R1-3。

樣品的制備：將待測(cè)液于4 ℃下1 000 r/min離心15 min，取上層清液過0.22 μm微孔濾膜后備用。

色譜條件：日立生理體液分析柱PF (4.6 mm l.D.×60 mm)；反應(yīng)柱溫度135 ℃；流動(dòng)相流速為0.35 mL/min，反應(yīng)液流速為0.30 mL/min；分離梯度條件及反應(yīng)液梯度條件見GB/T 30987—2014，檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為570和440 nm。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓣子制備過程中總蛋白質(zhì)含量變化

甜瓣子階段總蛋白含量變化結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，制曲0 d時(shí)蛋白質(zhì)含量為31.25 g/100 g，在制曲階段先略微上升，因?yàn)樵谥魄捌谖⑸镩_始生長(zhǎng)繁殖，由于孢子萌發(fā)的需要，部分糖類等通過呼吸作用轉(zhuǎn)化成CO2及水分釋放到環(huán)境中，而含氮代謝物積累到曲料中，導(dǎo)致總蛋白的少量升高[16]。甜瓣子發(fā)酵階段，總蛋白含量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，發(fā)酵15 d，總蛋白含量快速下降到25.31 g/100 g，由于一方面曲料與鹽水混合，在滲透壓作用下部分可溶性蛋白與鹽水發(fā)生物質(zhì)交換，溶解到池底發(fā)酵液中，另一方面蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下開始降解成多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，同時(shí)美拉德反應(yīng)也會(huì)消耗部分蛋白，轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)，從而導(dǎo)致總蛋白含量的減少。發(fā)酵后期蛋白質(zhì)降解速率減緩，發(fā)酵90 d結(jié)束后，總蛋白質(zhì)含量為19.17 g/100 g，總體下降38.78%。

圖1 甜瓣子發(fā)酵總蛋白質(zhì)含量變化

2.2 甜瓣子發(fā)酵階段各組分蛋白含量變化

甜瓣子發(fā)酵階段，不同蛋白組分含量變化如圖2所示。由圖2可以看出，制曲開始前，原料中水溶、鹽溶、醇溶和麥谷蛋白質(zhì)含量分別為6.64、9.06、0.63、9.20 g/100 g。醇溶蛋白主要來自于原料中面粉，整個(gè)甜瓣子發(fā)酵階段，醇溶蛋白含量極低，且沒有顯著變化，所以醇溶蛋白降解對(duì)郫縣豆瓣風(fēng)味品質(zhì)影響較小。而水溶、鹽溶及麥谷蛋白在制曲階段含量均有部分升高，制曲7 d后分別達(dá)到8.18、 10.05和9.28 g/100 g，可能是部分不溶性氮被分解成肽、氨基酸等可溶性氮，同時(shí)微生物在大量繁殖的過程中也會(huì)產(chǎn)生菌體蛋白和各種酶[17]。甜瓣子發(fā)酵階段前期，鹽溶蛋白含量快速下降，發(fā)酵15 d時(shí)含量下降到1.35 g/100 g，這是由于鹽溶蛋白在水中溶解度極低，但受NaCl濃度升高的影響，蛋白質(zhì)表面電荷增加，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子和水分子間相互作用力，促進(jìn)鹽溶蛋白的鹽溶、鹽析反應(yīng)[18-19]，導(dǎo)致甜瓣子階段鹽溶蛋白大量溶出沉淀至發(fā)酵池底部的鹽水環(huán)境中，對(duì)甜瓣子蛋白降解貢獻(xiàn)較小。而甜瓣子發(fā)酵前期水溶蛋白含量有明顯增加，發(fā)酵15 d后增長(zhǎng)到12.26 g/100 g，一部分來源于微生物菌體自溶，另一部分來自于微生物所產(chǎn)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解，原料中難溶的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化為可溶性小分子蛋白[20-21]，發(fā)酵后期開始逐步下降并趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其含量為7.72 g/100 g。麥谷蛋白在甜瓣子發(fā)酵階段一直保持明顯下降趨勢(shì)，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，酸性物質(zhì)的積累導(dǎo)致環(huán)境pH不斷降低，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶活力逐漸減弱，麥谷蛋白降解作用被進(jìn)一步抑制，發(fā)酵結(jié)束后其含量下降到6.54 g/100 g。

圖2 郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段不同蛋白組分含量

2.3 甜瓣子發(fā)酵階段各組分蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析

根據(jù)前述分析，甜瓣子發(fā)酵階段主要降解蛋白質(zhì)為水溶蛋白和麥谷蛋白，而SDS-PAGE能直觀反映甜瓣子發(fā)酵階段蛋白亞基間發(fā)生的聚集、降解等情況。對(duì)2種蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，如圖3所示，2種蛋白亞基在制曲階段分布各有異同，但分布范圍均集中在20～60 kDa之間。制曲階段各組分蛋白亞基均無明顯變化，水溶蛋白在30和20 kDa處有1條明顯條帶，而麥谷蛋白在30～40 kDa間有1條較粗條帶，甜瓣子發(fā)酵開始后2種蛋白質(zhì)降解反應(yīng)劇烈，由大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白亞基或者更小的肽段等。水溶蛋白在發(fā)酵15 d后,30 kDa以上蛋白條帶逐漸變淺，大分子蛋白發(fā)生降解，并降解成1條集中在20 kDa附近的明顯條帶，但30～50 kDa之間仍存在部分條帶，說明在甜瓣子發(fā)酵階段后期水溶蛋白酶解不徹底。而麥谷蛋白則在發(fā)酵前30 d快速降解，甜瓣子發(fā)酵15 d時(shí)大分子蛋白條帶逐漸變淺，發(fā)酵30 d后30 kDa以上條帶已基本消失，20 kDa附近蛋白質(zhì)亞基條帶逐漸加深，可以看出在發(fā)酵前30 d水溶蛋白和麥谷蛋白均發(fā)生明顯降解，由大分子蛋白降解生成小分子蛋白亞基或者多肽及氨基酸，在發(fā)酵過程后期小分子蛋白亞基呈不斷積累的趨勢(shì)。由此可知，郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段水溶蛋白和麥谷蛋白降解顯著，說明此2種蛋白是郫縣豆瓣風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)鍵蛋白。

a-水溶蛋白;b-麥谷蛋白

2.4 甜瓣子發(fā)酵階段多肽含量變化

由圖4可以看出，制曲開始時(shí)多肽含量為1.29 mg/g，制曲階段多肽含量沒有明顯變化。從總蛋白質(zhì)含量變化及SDS-PAGE電泳分析可以看出，蛋白質(zhì)在甜瓣子發(fā)酵前期降解作用劇烈，但甜瓣子發(fā)酵15 d時(shí)多肽含量快速下降到0.96 mg/g，可能是部分多肽快速降解生成氨基酸等小分子物質(zhì)，還有部分多肽釋放到發(fā)酵環(huán)境中。刁文睿等[22]發(fā)現(xiàn)在醋漬花生多肽含量變化中也出現(xiàn)相似情況。而后隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，多肽含量開始逐漸上升，并在后期趨于穩(wěn)定，說明在甜瓣子發(fā)酵后期，隨著蛋白酶活性的降低和蛋白質(zhì)降解作用的減弱，多肽被更多地分解成游離氨基酸，多肽的形成速率與消耗速率實(shí)現(xiàn)相對(duì)平衡，發(fā)酵結(jié)束后含量達(dá)到1.31 mg/g。

圖4 郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段多肽含量

2.5 甜瓣子發(fā)酵階段游離氨基酸含量

甜瓣子階段游離氨基酸含量變化趨勢(shì)如表1所示。游離氨基酸由蛋白質(zhì)及多肽降解產(chǎn)生，是郫縣豆瓣的一種重要呈味物質(zhì)，對(duì)郫縣豆瓣風(fēng)味構(gòu)成起到重要作用[4]。由表1可以看出，制曲階段共檢出19種氨基酸，且該階段總量變化不明顯，而甜瓣子發(fā)酵15 d后游離氨基酸總量迅速上升到30.987 mg/g，說明甜瓣子發(fā)酵前期蛋白降解作用劇烈，蛋白質(zhì)在蛋白酶、肽酶的作用下快速水解，生成大量氨基酸，同時(shí)此階段美拉德反應(yīng)等消耗氨基酸的反應(yīng)程度較弱，從而導(dǎo)致氨基酸含量的快速增長(zhǎng)。隨后甜瓣子發(fā)酵中期游離氨基酸含量增長(zhǎng)緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定，此時(shí)受發(fā)酵環(huán)境影響，蛋白酶活性被抑制，蛋白質(zhì)降解作用減弱，氨基酸更多地參與美拉德反應(yīng)及分解生成其他小分子風(fēng)味物質(zhì)，氨基酸的積累速率與消耗速率達(dá)到平衡狀態(tài)。而發(fā)酵后期隨著酸性物質(zhì)的積累，發(fā)酵環(huán)境pH不斷下降，酸性蛋白酶活力更高，促使更多的多肽分解成氨基酸，到甜瓣子發(fā)酵90 d結(jié)束后游離氨基酸總量積累到50.219 mg/g。

表1 郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段游離氨基酸變化 單位：mg/g

參考PARK等[23]將游離氨基酸據(jù)呈味特性分為5類，即甜鮮味、鮮酸味、苦甜味、苦味、咸味。其中呈甜鮮味、鮮酸味和苦味游離氨基酸含量最高，并且甜瓣子發(fā)酵90 d時(shí)呈甜鮮味和鮮酸味氨基酸總量接近其發(fā)酵30 d時(shí)的2倍，增長(zhǎng)的絕對(duì)量最大。結(jié)合SDS-PAGE電泳結(jié)果分析推測(cè)水溶蛋白與郫縣豆瓣風(fēng)味形成關(guān)系更加密切，同時(shí)本研究也從分子層面解釋了甜瓣子發(fā)酵90 d以上才能達(dá)到甜瓣子的成熟度，即具有醇厚味和濃郁酯香。除精氨酸外大部分游離氨基酸呈總體上升趨勢(shì)，谷氨酰胺僅在制曲階段檢出，含量較高(≥1 mg/g)的游離氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸，呈鮮酸味的谷氨酸和天冬氨酸增長(zhǎng)率最高，發(fā)酵結(jié)束后分別增長(zhǎng)5.60和7.81倍。在發(fā)酵前期各類呈味氨基酸總量差異不大，而發(fā)酵90 d結(jié)束后含量最高的呈味氨基酸依次是鮮酸味、苦味和甜鮮味氨基酸，總量分別達(dá)到16.140、14.652及11.829 mg/g。

3 結(jié)果與討論

研究發(fā)現(xiàn)甜瓣子中水溶蛋白和麥谷蛋白在發(fā)酵前30 d快速降解，所以多肽含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，而游離氨基酸含量在發(fā)酵前期增長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)快速達(dá)到峰值50.219 mg/g。

郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段主要是水溶蛋白和麥谷蛋白在甜瓣子發(fā)酵前期發(fā)生快速降解，發(fā)酵結(jié)束后仍有部分蛋白降解不徹底，原因是甜瓣子發(fā)酵后期由于高鹽環(huán)境的脅迫、酸性物質(zhì)的積累和某些微生物代謝物質(zhì)的產(chǎn)生，抑制其蛋白酶酶活力，蛋白質(zhì)降解作用減弱并趨于穩(wěn)定[24-25]。多肽的生成依賴堿性及中性蛋白酶等蛋白內(nèi)切酶的作用，而酸性蛋白酶等肽酶將多肽分解成氨基酸[26]，隨著發(fā)酵環(huán)境pH不斷降低，后期酸性蛋白酶活力更高，促使多肽分解成游離氨基酸，導(dǎo)致在發(fā)酵后期多肽含量增長(zhǎng)緩慢。游離氨基酸含量在甜瓣子發(fā)酵階段呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但在甜瓣子發(fā)酵中期增長(zhǎng)緩慢，可能是部分游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)或作為前體物被消耗生成小分子風(fēng)味物質(zhì)，其生成速率與消耗速率相持平，到發(fā)酵后期隨著酸性蛋白酶占據(jù)主導(dǎo)地位，游離氨基酸總量有顯著提高，與后期多肽含量增長(zhǎng)速率減緩相印證。根據(jù)呈味特性對(duì)氨基酸進(jìn)行分類，含量最高的游離氨基酸依次為鮮酸味、苦味和甜鮮味氨基酸，說明隨著發(fā)酵的長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行，不僅會(huì)使郫縣豆瓣鮮味提高，賦予它豐富醇厚的口感，同時(shí)也會(huì)積累大量苦味氨基酸，進(jìn)而產(chǎn)生苦味衍生物，影響郫縣豆瓣的風(fēng)味[27]。所以要提高郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段蛋白質(zhì)利用率，一方面要提高發(fā)酵后期蛋白酶活力，減緩其在高鹽環(huán)境中的失活速率，另一方面還要加強(qiáng)米曲霉等微生物分泌酶系研究，根據(jù)產(chǎn)品品質(zhì)需要，適當(dāng)補(bǔ)充相關(guān)酶，滿足不斷變化的發(fā)酵環(huán)境需求。同時(shí)在后期發(fā)酵中也要關(guān)注游離氨基酸的構(gòu)成，不能一味延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，避免產(chǎn)生令人不悅的風(fēng)味。