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Tween 20與蛋白質(zhì)相互作用后對(duì)乳液物理及氧化穩(wěn)定性的影響

2020-07-22 02:13:24張?zhí)┴?/span>何姍張雨晴王寧黃國(guó)隋曉楠江連洲
食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年13期
關(guān)鍵詞:水相乳液張力

張?zhí)┴?,何姍,張雨晴,王寧,黃國(guó),隋曉楠,江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150030)

大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)是一種高營(yíng)養(yǎng)的植物蛋白,具有無(wú)色無(wú)味、易于消化、含有豐富的氨基酸等特點(diǎn)。以SPI穩(wěn)定的水包油乳液,會(huì)在油滴表面吸附上一層蛋白,形成相對(duì)穩(wěn)定的界面蛋白保護(hù)膜,從而能夠降低體系的界面張力,進(jìn)而使乳液達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)[1]。

Tween 20是一種非離子型多聚乙醚類低分子表面活性劑,具有增溶、乳化和穩(wěn)定等功能,同時(shí)具有價(jià)格低廉、化學(xué)性穩(wěn)定和無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。Tween 20與蛋白質(zhì)的相互作用研究受到了廣泛關(guān)注。蛋白-低分子表面活性劑混合物的界面或乳化特性方面通常存在協(xié)同或?qū)沟淖饔肹2]。

水包油(oil in water, O/W)乳液是油脂存在于食品中相對(duì)常見的分散體系,在食品應(yīng)用中蛋白質(zhì)和小分子表面活性劑一般共存。早期乳液的利用體現(xiàn)在乳制品,如牛奶和酸奶等。在化妝品領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛,所有的護(hù)膚霜和潤(rùn)膚露等都是乳液。SPI和Tween 20是2種重要類型的乳化劑。Tween 20能形成比SPI大一些的界面壓,因而具有更小的界面張力。隨著Tween 20濃度的增大,吸附在界面上的SPI會(huì)逐漸被Tween 20置換,進(jìn)入水相,最終形成小分子吸附層,該過程稱為界面取代過程[3]。

關(guān)于含有Tween 20乳液體系的研究已有一些報(bào)道[4-5],小分子表面活性劑在乳液中的應(yīng)用逐漸成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。ARANCIBIA等[6]研究表明,Tween 80比卵磷脂更有效,可用于開發(fā)具有良好物理性能的天然納米乳劑。KALTSA等[7]研究了Tween 20將乳清分離蛋白置換后,界面上發(fā)生的一些特性變化,乳液粒徑隨Tween 20的增大而減小。CAI等[8]研究表明,小分子表面活性劑形成的界面膜的黏彈性較差,含有蛋白的膠體系統(tǒng)通常更穩(wěn)定。楊力會(huì)等[9]研究了Tween 20添加量為 0.005% 時(shí),可使油脂氧化相對(duì)緩慢;當(dāng)Tween 20含量增加到 0.01%~0.20%時(shí),在一定程度上會(huì)起到促進(jìn)氧化的效果。

本研究旨在對(duì)SPI與Tween 20 的乳液體系的物理及氧化穩(wěn)定性進(jìn)行探討,以期為制備含Tween 20的蛋白質(zhì)乳液提供技術(shù)支撐,也為O/W乳液體系的物理及氧化特性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆,市售;低溫脫脂豆粕,實(shí)驗(yàn)室自制;大豆分離蛋白,實(shí)驗(yàn)室自制;核桃油,吉林省姜炳堂商貿(mào)有限公司;牛血清白蛋白、Tween 20,美國(guó)Sigma 試劑公司;2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH),阿拉丁試劑上海有限公司;2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid, TBA),上海展云化工有限公司;HCl、NaOH等試劑為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T18 digital ULTRA TURRAX粗均機(jī),德國(guó)艾卡公司; Mastersizer 2 000 Nano-ZS90激光粒度儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司; FD5-3 型冷凍干燥機(jī),美國(guó) SIM 公司;Tecan Infinite 200 Pro 酶標(biāo)儀,瑞士帝肯公司;KjelFlex K-360凱氏定氮儀,上海纖檢儀器有限公司;高壓均質(zhì)機(jī),鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;XG-CAM系列接觸角測(cè)量?jī)x,上海軒鐵創(chuàng)析工業(yè)設(shè)備有限公司;RF-6000熒光分光光度計(jì),日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考 HUANG等[10]的方法稍作修改,將粉碎后的大豆粉用正己烷脫脂3次(1 g大豆粉用3 mL正己烷脫脂),并將脫脂豆粉放置于通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行干燥,去除易揮發(fā)的正己烷。用蒸餾水將得到的粉末按照1∶15(g∶mL)進(jìn)行溶解,用2 mol/L NaOH將溶液pH 調(diào)節(jié)到8.0,并在室溫下進(jìn)行磁力攪拌2 h。將混合液在4 ℃下14 000 r/min離心15 min,收集上清液。用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.5,隨后進(jìn)行離心15 min(4 ℃,4 000 r/min)。棄上清液,將沉淀物從離心筒中取出并溶解在裝有蒸餾水的燒杯中,用蒸餾水將沉淀物反復(fù)洗滌3次,用2 mol/L NaOH將pH值調(diào)至中性,倒入玻璃培養(yǎng)皿中放入冰箱冷凍層。之后用凍干機(jī)凍干,進(jìn)行研磨,最后得到大豆分離蛋白粉末。并由凱氏定氮方法測(cè)得 SPI 的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(91.3±0.60)% (N×5.71)。

1.3.2 大豆分離蛋白乳液的制備

稱取一定質(zhì)量的SPI 粉末并在磷酸鹽緩沖液(phosphate bulfer saline, PBS)(5 mmol/L,pH 7)中溶解,在室溫下低速攪拌3 h至充分溶解,隨后放入冰箱水化過夜,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的蛋白溶液作為水相備用。將50 g/L核桃油與950 g/L水化好的蛋白質(zhì)溶液通過3次粗均(10 000 r/min,1 min)后制備出粗乳液。然后將粗乳液用高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)均質(zhì)3次(8~35 MPa),最終得到乳液樣品。整個(gè)過程在冰水浴下進(jìn)行,防止高溫引起SPI變性。制備得到4種乳液樣品分別為:10 g/L SPI(SPI);10 g/L SPI+5 g/L Tween 20(SPI+T5);10 g/L SPI+10 g/L Tween 20(SPI+T10);10 g/L Tween 20(T10)的乳液樣品。在所有乳液樣品中加入0.2 g/L疊氮化鈉抑制微生物生長(zhǎng)[11]。取部分乳液作為新鮮乳液置于冰箱存放,將剩余乳液分裝在帶蓋玻璃瓶中。乳液在50 ℃黑暗中保持6 d,收集樣品定期進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)[12]。

1.3.3 乳液粒度和粒徑分布測(cè)定

參考YANG等[13]的方法并稍加修改,使用激光粒度儀對(duì)所有樣品進(jìn)行平均粒度測(cè)定。為避免多個(gè)顆粒的相聚和散射產(chǎn)生影響,在分析之前將樣品用PBS(5 mmol/L,pH 7) 稀釋500倍。水相(PBS)和油相(核桃油)的折射率分別設(shè)定為1.330和1.434,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。由粒度分布計(jì)算體積加權(quán)(d4,3)平均粒徑。d4,3值用于監(jiān)測(cè)乳液聚集的穩(wěn)定性。

1.3.4 乳液顯微鏡形貌觀察

將制備好的乳液用pH 7.0的PBS稀釋50倍,用漩渦振蕩器混勻后,用移液槍取40 μL滴于載玻片中心處,并從一側(cè)緩慢蓋上載玻片,采用光學(xué)顯微鏡觀察乳滴結(jié)構(gòu)(100倍油鏡)。

1.3.5 Zeta電位的測(cè)定

參考XU等[14]的方法稍作修改,通過使用激光粒度儀測(cè)量所有樣品的Zeta電位(mV)。在測(cè)量之前用PBS(5 mmol/L,pH 7)稀釋乳液樣品,稀釋倍數(shù)為500倍,以避免多個(gè)顆粒的相聚。用電位杯量取1 mL左右樣品(25 ℃,溫度平衡時(shí)間為2 min)。每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)量。

1.3.6 界面張力測(cè)定

根據(jù)LIU等[15]的方法進(jìn)行改進(jìn),使用接觸角測(cè)量?jī)x(XG-CAM系列)測(cè)定油-水界面處的界面張力。核桃油為油相,用PBS(5 mmol/L,pH 7)配制10 g/L SPI溶液作為水相。通過將不同濃度Tween 20分散在PBS(5 mmol/L,pH 7)中來改變水相的組成。將針尖端放置在光源和相機(jī)(CCD)之間的光學(xué)平板上;將水相倒入樣品杯中;將鉑片浸入水相中并將其拉至界面;在水相中將核桃油相緩慢加入,直到鉑片完全浸沒在油中。用數(shù)碼相機(jī)捕獲每個(gè)油滴的圖像,然后通過儀器制造商提供的Young-Laplace方程程序分析油滴的形狀來計(jì)算界面張力(γ)。

1.3.7 熒光光譜分析

根據(jù)ROY等[16]的方法稍作修改,測(cè)定內(nèi)在的色氨酸熒光。將乳液樣品(10 μL)在PBS(5 mmol/L,pH 7)中稀釋,漩渦振蕩并靜置后分別加入到石英比色皿中,然后使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行分析。參數(shù)設(shè)定為:色氨酸的發(fā)射光譜200~500 nm,掃描速度1 nm/s,激發(fā)波長(zhǎng)297 nm。發(fā)射光帶寬20 nm,激發(fā)光帶寬10 nm。記錄光譜的最大發(fā)射強(qiáng)度用于分析。

1.3.8 油脂氧化初級(jí)產(chǎn)物的測(cè)定

根據(jù)DING等[17]的方法稍作修改,用油脂氧化初級(jí)產(chǎn)物即脂質(zhì)氫過氧化物的含量來衡量乳液中油脂氧化的程度。將制備好的4種乳液樣品分別放置在10 mL帶蓋玻璃樣品瓶中,每類乳狀液各3份放置在 50 ℃恒溫避光的烘箱中進(jìn)行烘箱加速試驗(yàn),間隔24 h測(cè)量1次。

取0.3 mL乳液與1.5 mL提取溶劑[V(異辛烷)∶V(異丙醇)=3∶1]混合,進(jìn)行渦旋振蕩(10 s、3次),在1 000×g下離心2 min,收集有機(jī)溶劑相。取200 μL加入到2.8 mL混合溶液[V(甲醇)∶V(丁醇)=2∶1]中,再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨和15 μL亞鐵溶液(混合等體積的0.132 mol/L BaCl2和0.144 mol/L FeSO4過0.220 μm濾膜)制備得到。在室溫下靜置反應(yīng)20 min后,使用酶標(biāo)儀96透明孔板,在510 nm下測(cè)乳液樣品的吸光度。用氫過氧化物標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算乳液樣品中脂質(zhì)氫過氧化物值。

1.3.9 硫代巴比妥酸產(chǎn)物值的測(cè)定

根據(jù)SHEN等[18]的方法稍作修改。對(duì)于硫代巴比妥酸產(chǎn)物值(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)進(jìn)行分析,將1.0 mL乳液樣品與2.0 mL含有150 g/L三氯乙酸和3.75 g/L TBA試劑混合,混勻后煮沸30 min。將冷卻的上清液用氯仿處理,并在2 200×g下離心20 min。在532 nm處測(cè)定上清液的吸光度,并根據(jù)由1,1,3,3-四乙氧基丙烷(μmol/L乳液)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定TBARS值。TBARS值以丙二醛的含量計(jì),按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中,A532, 溶液的吸光度;V, 樣品液體體積,mL;M,TBA的摩爾質(zhì)量, 144.15 g/mol;m, 樣品質(zhì)量, g;l, 光程1 cm;ε, 摩爾消光系數(shù), 152 000 L/(mol·cm)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn),利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,利用Origin 9.1軟件作圖,采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(analysis of variance,ANOVA),利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析及相關(guān)性分析,P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液粒度和粒徑分布

乳液粒徑是衡量乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[19]。d4,3表示液滴體積平均直徑。乳液在均勻化過程中,Tween 20促進(jìn)乳滴破裂并抑制乳滴的聚結(jié),從而導(dǎo)致乳滴尺寸變小[20-21]。圖1-a表明,乳滴粒徑隨Tween 20 濃度逐漸增大而減小,表明吸附在油滴上的蛋白被逐漸置換,平均粒徑變小,這與袁媛等[22]研究結(jié)果相似。KALTSA等[7]研究表明,乳清蛋白乳化橄欖油液滴,在均質(zhì)過程中其粒徑隨Tween 20的增大而減小,界面組成也隨之發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:SPI+10 g/L Tween 20穩(wěn)定乳液的平均粒徑為(243.07±0.043)nm,顯著低于10 g/L Tween 20穩(wěn)定乳液的平均粒徑(286.23±0.031)nm(P<0.05)。該結(jié)果與界面張力測(cè)量結(jié)果一致,表明混合乳化劑(10 g/L SPI+10 g/L Tween 20)比單獨(dú)使用表面活性劑(10 g/L Tween 20)更能降低界面張力。乳液在儲(chǔ)存過程中沒有發(fā)生相分離,表明所有體系對(duì)乳滴的聚集和乳化都是穩(wěn)定的。因此,Tween 20對(duì)SPI的界面置換不影響乳液的物理穩(wěn)定性。先前的研究表明,當(dāng)所有系統(tǒng)都包含相對(duì)較小的乳滴時(shí),乳滴尺寸不會(huì)對(duì)乳液中的氧化產(chǎn)生重大影響[23-24]。

界面取代對(duì)乳滴粒度分布的影響如圖1-b所示,不含Tween 20的乳液粒徑較大,隨著Tween 20濃度增加,其分布趨于集中,表明乳液的物理穩(wěn)定性隨Tween 20濃度的增大而增強(qiáng)。

圖1 Tween 20濃度變化對(duì)粒度分布(a)和乳液平均粒徑(b)的影響

2.2 乳液微觀形貌觀察

由圖2可知,乳滴都分布均勻且沒有發(fā)生聚集,當(dāng)Tween 20濃度增大時(shí),乳滴出現(xiàn)減小趨勢(shì),可能由于與SPI分子相比,Tween 20具有更小的界面張力對(duì)油滴分子起到壓縮作用,從而出現(xiàn)了乳滴逐漸減小的情況[25]。

a-SPI;b-SPI+T5;c-SPI+T10;d-T10

2.3 Zeta電位分析

Zeta電位反映了溶液中粒子間的相互作用力,從而體現(xiàn)出乳液的物理穩(wěn)定性。由圖3可知,在沒有Tween 20的情況下,液滴穩(wěn)定后SPI帶負(fù)電荷,在pH 7時(shí),電位值為-25.8 mV,這可以歸因于吸附蛋白質(zhì)高于他們的等電點(diǎn)[26]。隨 Tween 20 濃度的不斷增加,乳滴電位的絕對(duì)值都呈現(xiàn)降低趨勢(shì),帶電蛋白質(zhì)逐步被 Tween 20 取代進(jìn)入水相,因而導(dǎo)致乳滴界面電位絕對(duì)值減小,這與KALTSA[7]研究結(jié)果一致。在添加10 g/L Tween 20后,電位值為-16.7 mV,它的電位絕對(duì)值高于單純含10 g/L的Tween 20(電位值為-15.3 mV),說明仍有少量蛋白質(zhì)殘留在乳滴表面。

圖3 Tween 20濃度變化對(duì)乳液粒子電位的影響

2.4 Tween 20添加量對(duì)界面張力的影響

有研究表明,界面張力的大小可以反映乳液形成的難易程度,評(píng)估表面活性劑誘導(dǎo)在乳液中界面發(fā)生吸附和置換的行為[27]。由圖4可知,只含有10 g/L SPI的乳液界面張力約為(17.2±0.034) mN/m,隨著Tween 20從0.0增加到10 g/L,界面張力明顯下降(P<0.05)。10 g/L SPI+10 g/L Tween 20混合物的界面張力(10.3±0.026) mN/m低于10 g/L SPI(17.2±0.034)mN/m和10 g/L Tween 20(12.3±0.039)mN/m界面張力,表明蛋白質(zhì)和Tween 20的混合物能夠更有效地降低油相和水相之間的疏水相互作用,與WAN等[2]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在Tween 20質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),混合體系的界面張力與Tween 20的界面張力接近,說明界面主要被非離子表面活性劑所覆蓋,LOPEZ等[28]也得到了相同的結(jié)果。

圖4 Tween 20濃度變化對(duì)乳液界面張力的影響

2.5 熒光光譜分析

乳液中內(nèi)在色氨酸熒光強(qiáng)度變化可以作為評(píng)估蛋白質(zhì)氧化修飾的指標(biāo)。由圖5可知,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,乳液樣品中蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度在50 ℃黑暗環(huán)境中呈現(xiàn)出不斷減弱的趨勢(shì),表明蛋白質(zhì)逐漸被氧化發(fā)生結(jié)構(gòu)修飾[29],這與QIU等[30]研究結(jié)果相似。在含SPI的3個(gè)樣品乳液中,不含Tween 20的SPI乳液熒光損失最大(P<0.05),Tween 20加入導(dǎo)致SPI被置換進(jìn)入水相,因而導(dǎo)致油脂氧化速率變低,說明吸附的蛋白質(zhì)可能在乳劑制備過程中抑制了油脂氧化[31]。隨著乳狀液中Tween 20濃度增加,蛋白質(zhì)氧化程度再次降低,表現(xiàn)為貯藏過程中熒光損耗降低[32]。NIU等[33]研究了脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛使乳清分離蛋白熒光猝滅,熒光強(qiáng)度降低,表明蛋白質(zhì)分子與Tween 20發(fā)生置換后,油脂氧化情況也隨之改變[34]。相比于含有Tween 20的乳液體系,不含 Tween 20的SPI的乳液氧化穩(wěn)定性較好, 這與YANG等[1]和BERTON等[35]研究結(jié)果一致。

圖5 Tween 20濃度變化對(duì)乳劑熒光強(qiáng)度的影響

2.6 Tween 20 添加量對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響

2.6.1 油脂初級(jí)氧化產(chǎn)物分析

由圖6看出,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,4種樣品的氫過氧化物含量都在逐漸增加;含有Tween 20的乳劑氫過氧化物含量增加更快,油脂氧化穩(wěn)定性降低。吸附在界面上的SPI逐漸被Tween 20取代進(jìn)入水相,表明發(fā)生界面取代后,乳液氧化穩(wěn)定性降低,這與KIOKIAS等[36]的研究結(jié)果一致。

圖6 Tween 20濃度變化對(duì)乳液中氫過氧化物的影響

結(jié)果表明,SPI在抑制脂質(zhì)氧化方面比Tween 20更有效,與KIOKIAS等[36]研究結(jié)果一致。Tween 20含量的增加導(dǎo)致O/W乳液的氧化穩(wěn)定性明顯降低,這可以從脂質(zhì)過氧化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到證明[36]。

2.6.2 TBARS分析

TBARS值可測(cè)定乳液中次級(jí)氧化產(chǎn)物的含量。由圖7可知,在烘箱加速實(shí)驗(yàn)中,TBARS的變化趨勢(shì)和氫過氧化物值的趨勢(shì)相似,隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加,TBARS值逐漸升高,表明油脂的氧化速率增大。

圖7 Tween 20濃度變化對(duì)TBARS濃度的影響

而Tween 20的加入使TBARS值增加,并且在儲(chǔ)存后期曲線變陡,說明乳液氧化情況加劇。以上這些結(jié)果表明SPI抑制油脂氧化比Tween 20更有效,這與VIREN[37]、HAAHR[38]等研究結(jié)果一致。Tween 20比例的增加導(dǎo)致了乳劑的氧化穩(wěn)定性明顯下降。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了用Tween 20與SPI制成的乳液體系對(duì)乳液的物理和氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,在O/W乳液中油脂和蛋白發(fā)生氧化并且受到蛋白質(zhì)分子位置的影響。Tween 20存在時(shí),蛋白質(zhì)分子從油滴表面被部分取代,也改變了它們的氧化敏感性。乳滴粒徑和顯微鏡觀察結(jié)果表明,隨Tween 20濃度逐漸增大,乳滴不斷減小,界面中的SPI不斷被置換下來。乳滴電位的絕對(duì)值和界面張力都呈現(xiàn)降低趨勢(shì),表明蛋白質(zhì)和Tween 20的乳液體系能更有效地降低油相和水相之間的疏水相互作用,表明在添加了Tween 20之后,物理穩(wěn)定性較好。烘箱加速實(shí)驗(yàn)表明,在儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度不斷變小,表明Tween 20在乳液中界面發(fā)生吸附和置換。與含有Tween 20的乳液體系相比,只含SPI的乳液脂質(zhì)氧化速率最低,說明吸附的蛋白質(zhì)可能在乳劑制備過程中抑制了脂質(zhì)氧化。4種樣品的氫過氧化物和TBARS值都在增大,但Tween 20的加入,使乳液中的氫過氧化物含量增加更快。這表明在儲(chǔ)存過程中,油脂氧化穩(wěn)定性降低,而Tween 20的加入使其穩(wěn)定性加速降低。Tween 20與蛋白質(zhì)共存體系比純 Tween 20體系的乳液更穩(wěn)定。以上結(jié)果為含小分子表面活性劑的蛋白質(zhì)乳液在食品加工中的應(yīng)用提供參考。

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