黃笑非，屈彤彤，丁洋，雷彤彤，張潔，唐選明*

1(中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100193) 2(北京物資學院，物流學院/北京市物流系統(tǒng)與技術重點實驗室，北京，101149)

果蔬品質(zhì)在采后貯藏過程中逐漸下降，因此常選擇低溫來延長果蔬貯藏壽命，維持果蔬的品質(zhì)質(zhì)量[1]。溫度極大影響著采后果蔬的貯藏品質(zhì)[2]，若貯藏溫度過低，會導致諸如番茄、黃瓜等冷敏型果蔬發(fā)生冷害[3]。冷害是指貯藏溫度降到果蔬自身所能忍受的極限以下時所受到的傷害[4]，冷害癥狀往往不會在貯藏過程中出現(xiàn)，而是將果蔬轉(zhuǎn)移到常溫下才會表現(xiàn)出來。番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界上最重要也是應用最廣泛的果蔬之一，常作為研究冷害的模型植物[5]。番茄的冷害癥狀主要有果皮褐變、表面出現(xiàn)凹陷、水漬狀斑點、干疤、腐爛加快等[6-7]，造成果實嚴重腐爛和品質(zhì)劣變，縮短了果實貨架期，限制了低溫技術在番茄等冷敏性果蔬貯藏中的應用。

赤霉素(gibberellins，GAs)作為一種重要的植物內(nèi)源性激素，在促進植物細胞分裂、促進植物器官生長、增強植物抗冷性等方面都發(fā)揮著十分重要的作用[8-10]。司敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對發(fā)育期的李果實進行100 mg/L赤霉素處理，能夠有效控制李果實的冷害癥狀；ZHU等[12]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L赤霉素處理能有效保持番茄果實膜的穩(wěn)定性，維持細胞壁完整性，降低低溫貯藏條件下番茄果實中抗氧化酶的活性，從而提高采后番茄果實的抗冷能力。在活性赤霉素的生物合成途徑中，貝殼杉烯合酶是合成前期階段的重要因素，赤霉素缺失型突變株gib-3正是由于該酶活性喪失，無法合成貝殼杉烯[13]；貝殼杉烯作為GA合成的前體物質(zhì)，它的缺失造成植株內(nèi)赤霉素合成受阻，從而導致植株內(nèi)赤霉素缺失，產(chǎn)生植物矮化、節(jié)間短、果實小等不良癥狀[14]。目前對于赤霉素缺失對番茄果實抗冷性影響的研究較少，關于赤霉素增強采后番茄果實抗冷性綜合機制的建立仍不全面。本研究采取綠熟期的野生型番茄果實和赤霉素缺失型番茄果實為實驗材料，統(tǒng)計番茄果實的冷害指數(shù)，觀察番茄果實的超微結(jié)構，從赤霉素缺失時細胞膜相關酶、細胞壁相關酶、抗氧化相關酶、抗逆相關酶方面入手，探究赤霉素缺失對番茄果實抗冷性的影響，從而明確赤霉素在采后番茄果實抗冷調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型番茄果實及赤霉素缺失型突變體番茄果實，種子由C.M. Rick Tomato Genetics Resource Center提供，種植并采摘于北京市昌平區(qū)金六環(huán)農(nóng)業(yè)生態(tài)園，挑選符合實驗要求的番茄果實進行研究。

環(huán)氧樹脂、十二烯基琥珀酸酐(dodeceny succinicanhydride, DDSA)(優(yōu)級品)，北京金銳林科技發(fā)展有限公司；戊二醛(98%)，湖北新景新材料有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinyulpyrrolidone, PVPP)(化學純)、核黃素(化學純)，美國Sigma公司；氮藍四唑(分析純)，美國Amresco公司；NaClO、H3PO4、乙醇、丙酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、乙酸、乙酸鈉、多聚半乳糖醛酸、3,5-二硝基水楊酸、乙二胺四乙酸、K3PO4、甲硫氨酸、H2O2均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；植物果膠甲酯酶檢測試劑盒，北京凱美特科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶活性檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 設備與儀器

ZHWY-200H溫型無級調(diào)幅振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；QM100(S)型高通量研磨儀，五洲鼎創(chuàng)(北京)科技有限公司；TGL-16k型湖南湘儀臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器有限責任公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用有限責任公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；SPARK型TECAN多功能酶標儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；YP502N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；MX-S型旋渦混勻器，上海京工實業(yè)有限公司；日立H-7500型透射電子顯微鏡，株式會社日立制作所。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗材料處理

將挑選好的大小、成熟度一致、無機械傷的野生型番茄果實(wild type, WT)和突變株番茄果實(gib-3)分別用水洗凈，用體積分數(shù)為1%的NaClO溶液浸泡消毒2 min，再以自來水沖洗并瀝干表面。將所有番茄果實于4 ℃下貯藏28 d，濕度控制在80%～90%。于貯藏第14、21、28天取樣，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后測量其冷害指數(shù)；于貯藏第21天取樣，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后觀察其超微結(jié)構；再于貯藏第0、3、7、14、21、28天對番茄果實的果皮進行取樣，分別測量番茄果實的離子滲透率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、磷脂酶D(phospholipase, PLD)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase， PAL)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase, GST)的活性變化。每組試驗均進行3次平行操作。

1.3.2 冷害指數(shù)測量

參考ZHAO等[15]的方法，略有改動。4 ℃下貯藏第14、21、28 天時，對gib-3和WT型番茄果實取樣，每組取樣20個，轉(zhuǎn)移至室溫下，3 d后統(tǒng)計冷害指數(shù)。

1.3.3 超微結(jié)構觀察

4 ℃下貯藏21 d時，對gib-3和WT型番茄果實取樣，每組取樣6個，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后制作透射電鏡樣片，觀察其超微結(jié)構。電鏡樣片的制作和觀察均在中國農(nóng)業(yè)科學院加工研究所電鏡室進行。用刀片將番茄果皮組織切成1 mm3的小塊， 用體積分數(shù)3%戊二醛溶液(pH 7.2)固定2～4 h， 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4) 清洗2 h，再用10 g/L四氧化鋨固定，不同濃度梯度的酒精脫水，無水丙酮置換，35 ℃下用丙酮以2∶1體積比混合液滲透2 h，環(huán)氧樹脂包埋，500～1 000 üA 超薄切片，醋酸雙氧鈾-鉛雙染，在透射電子顯微鏡下觀察表皮下層細胞的變化并拍照。

1.3.4 離子滲透率測定

參考ZHANG等[16]的方法，略有改動。用直徑6 cm的打孔器將番茄果實的果皮組織打成圓片，用蒸餾水洗滌后每6片轉(zhuǎn)移至盛有40 mL去離子水的錐形瓶中，測量電導率P0；室溫下?lián)u床振蕩2 h，測量電導率P1；置于沸水中煮沸10 min，立即冷卻至室溫，補充蒸發(fā)所散失的水分，測量電導率P2。離子滲透率(EI)按公式(1)計算：

(1)

1.3.5 MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法[17]測量番茄果實MDA含量，略有改動。分別取gib-3和WT型番茄果實的果皮組織，在液氮中研磨成粉末，取1.5 g番茄果皮組織粉末，加入7 mL的100 g/L三氯乙酸溶液提取，均質(zhì)后于4 ℃下8 000×g離心10 min，取2 mL上清液(WT型番茄果實組中加入2 mL三氯乙酸溶液)，向其中加入2 mL TBA溶液(6.7 g/L)并混勻，在95 ℃下水浴20 min，冷卻至室溫，于4 ℃下8 000×g離心10 min，取上清液分別測定450、532和600 nm下的吸光值。MDA含量以鮮重表示，按公式(2)、(3)計算：

cMDA/(μmol·L-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

(3)

式中：cMDA，MDA濃度，μmol/L；V，三氯乙酸(提取用)體積，mL；V1，反應體系體積，mL；V2，三氯乙酸(測定用)提取液體積，mL；m，樣品鮮重，g。

1.3.6 PLD、LOX活性測定

參考MAO等[18]的方法，對PLD、LOX活性進行測定。

1.3.7 PG、PME活性測定

PG活性的測定方法參考GAYATHRI等[19]的方法，PME活性使用植物果膠甲酯酶檢測試劑盒測定。

1.3.8 SOD、CAT活性測定

SOD和CAT活性均參考DING等[20]的方法測定。

1.3.9 PAL、GST活性測定

PAL和GST活性分別采用苯丙氨酸解氨酶活性檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗至少進行3次平行操作，試驗結(jié)果以平均值表示。使用SPSS 24軟件中的最小顯著性差異法和鄧肯分析對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素缺失對番茄果實冷害指數(shù)的影響

番茄果實在4 ℃下貯藏14、21、28 d，轉(zhuǎn)移到室溫3 d后開始出現(xiàn)冷害癥狀。如圖1-a所示，與WT型番茄果實相比，gib-3型番茄果實表面凹陷程度、干疤、果肉褐變程度更為嚴重，甚至出現(xiàn)了微生物侵染現(xiàn)象，且觸感比WT軟爛。如圖1-b所示，4 ℃下貯藏的番茄果實冷害指數(shù)呈顯著上升趨勢(P<0.05)，且gib-3型番茄果實的冷害指數(shù)顯著高于WT(P<0.05)。此外，貯藏第14、21、28天時，gib-3型番茄果實的冷害指數(shù)分別是WT的1.25、1.12、1.24倍。這表明，低溫貯藏下，赤霉素缺失加重了番茄果實的冷害癥狀，不利于番茄果實低溫下的長期貯藏。

圖1 赤霉素缺失對番茄果實冷害癥狀(a)和冷害指數(shù)(b)的影響

2.2 赤霉素缺失對番茄果實超微結(jié)構的影響

由于在4 ℃下貯藏21 d時，gib-3型番茄果實和WT的冷害指數(shù)差異最為顯著(P<0.05)，因此選取4 ℃下貯藏21 d的番茄果實進行超微結(jié)構的觀察。通過對番茄果實的果皮組織進行超微結(jié)構的觀察(圖2)，可以明顯看到，與WT相比，gib-3型番茄果實細胞壁破損現(xiàn)象更為嚴重，且細胞內(nèi)容物破碎，甚至泄漏至細胞外。另外，gib-3型番茄果實細胞壁較薄，且厚度不均勻，這可能是導致番茄果實果皮出現(xiàn)凹陷和果實軟爛的微觀原因[21]。在gib-3型番茄果實果皮細胞中，有較為明顯的退化的細胞器沉淀，可以清楚地觀察到質(zhì)壁分離等現(xiàn)象。這些微觀結(jié)構變化增大了細胞內(nèi)生理生化反應的接觸面積，加速了番茄果實的衰老和變質(zhì)，為病原菌的入侵提供了非常便利的條件[22]。由此可知，赤霉素缺失型番茄果實無法較好地保持低溫貯藏下果實細胞壁的完整性，加深了果實遭受冷害的程度。

圖2 赤霉素缺失對番茄果實超微結(jié)構的影響

2.3 赤霉素缺失對番茄果實MDA含量和離子滲透率的影響

MDA含量和離子滲透率的大小表明了低溫貯藏下番茄果實細胞膜的損傷程度和完整性[15]。MDA是膜脂肪酸過氧化反應的最終產(chǎn)物，MDA含量的增加表明細胞膜完整性受到損害，常作為氧化應激反應的標志[23]。如圖3-a所示，在整個貯藏期間，番茄果實的MDA含量逐漸升高，且gib-3型番茄果實的MDA含量顯著高于WT型番茄果實(P<0.05)；在貯藏第28天，gib-3番茄果實的MDA含量比WT高32.4%。這說明赤霉素缺失加速了膜脂的過氧化進程，無法避免番茄果實細胞膜遭受氧化損傷，無法維持細胞膜完整性，進而降低了其抗冷性。

離子滲透率常用來評價細胞膜透性損失，因此可以作為衡量細胞膜完整性的指標[24]。由圖3-b看出，在整個貯藏周期，番茄果實的離子滲透率呈逐漸上升的趨勢，且gib-3型番茄果實的離子滲透率顯著高于WT(P<0.05)。貯藏第28天時，兩者離子滲透率相差最大，達到24.67%。這表明赤霉素缺失提高了番茄果實的離子滲透率，增大了細胞膜透性。

圖3 赤霉素缺失對番茄果實MDA含量(a)和離子滲透率(b)的影響

2.4 赤霉素缺失對番茄果實細胞膜相關酶活性的影響

前人研究表明[18,24]，PLD和LOX等與磷脂代謝有關的酶活性增加會加快膜磷脂的氧化反應，增加脂質(zhì)不飽和度，增大細胞膜的流動性，破壞細胞膜磷脂雙分子層結(jié)構，導致細胞膜降解，逐漸失去穩(wěn)態(tài)。由圖4-a所示，gib-3型番茄果實的PLD活性顯著高于WT(P<0.05)，且活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。貯藏第14天時2種類型的番茄果實PLD活性迅速升高，可能是因為細胞中液泡破裂導致細胞質(zhì)變?yōu)樗嵝裕せ盍薖LD[24]。14 d之后，2種番茄果實的PLD活性逐漸下降，MAO等研究發(fā)現(xiàn)[18]，磷脂降解引起的膜硬化可能是貯藏后期番茄果實PLD活性降低的原因。

如圖4-b所示，低溫貯藏條件下，gib-3番茄果實的LOX活性顯著高于WT(P<0.05)，且2種番茄果實的LOX活性均呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢。貯藏21 d時達到峰值，此時WT的LOX活性為4 454.78 U/g，gib-3的LOX活性為6 486.37 U/g，比WT高45.6%；此后活性逐漸下降。貯藏后期LOX活性逐漸降低可能是由于膜脂過氧化反應的增加，使膜磷脂不飽和度升高，導致LOX的底物減少[18]。研究表明，PLD和LOX有協(xié)同作用，PLD可能為LOX的反應位點提供游離脂肪酸，兩者的協(xié)同作用會加速細胞膜磷脂的過氧化反應進程和降解速度，逐漸破壞細胞膜，引起冷害的發(fā)生[18]。

圖4 赤霉素缺失對番茄果實PLD活性(a)和LOX活性(b)的影響

2.5 赤霉素缺失對番茄果實細胞壁相關酶活性影響

冷害會影響果蔬的新陳代謝，導致番茄果實表面出現(xiàn)不正常成熟和損傷區(qū)域[26]，這些變化與細胞壁的完整性有關，其中果膠溶解和解聚作用的改變導致了上述癥狀的發(fā)生[21]。前人研究表明，PME、PG以及果膠裂解酶、半乳糖苷酶和阿拉伯糖苷酶等酶都參與了果膠的降解[21]，PG和PME酶活性越高，細胞壁破損程度越嚴重。KHADEMI等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PG通過促進果膠的降解來破壞細胞壁。圖5-a表明，在整個貯藏周期，gib-3型番茄果實的PG活性顯著高于WT(P<0.05)，且在0～14 d呈急速上升的趨勢，14 d達到峰值，其中WT型番茄果實PG活性為8.07 U/g，gib-3型果實PG活性為16.83 U/g，是WT的2.08倍。由圖5-b可知，gib-3型番茄果實的PME活性顯著高于WT(P<0.05)。貯藏至21 d時，兩者的PME活性均達到最大值，其中gib-3型番茄果實PME活性為354.11 U/L，WT型果實PME活性為312.54 U/L。以上結(jié)果表明，GA缺失會增大PG和PME的活性，加快番茄果實細胞壁降解速度，細胞壁破損現(xiàn)象嚴重，這與觀察番茄果實超微結(jié)構的結(jié)果相符合。

圖5 赤霉素缺失對番茄果實PG活性(a)和PME活性(b)的影響

生吉萍等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PG和LOX共同影響番茄果實的軟化，LOX加速脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生大量自由基促進了乙烯和脫落酸的生成，加速果實衰老；PG則加速果實細胞壁的降解，最終導致細胞膜和細胞壁破損，使果實軟爛。在本研究中，gib-3番茄果實的LOX活性在貯藏21 d前持續(xù)增加，PG也保持著顯著高于WT的活性(P<0.05)，導致GA缺失型番茄果實軟爛程度嚴重，抗冷性下降。

2.6 赤霉素缺失對番茄果實抗氧化相關酶活性影響

有研究表明，低溫等非生物脅迫會導致植物體內(nèi)活性氧和自由基的積累[28]。SOD和CAT等抗氧化酶能夠減少低溫脅迫引起的氧化損傷，對清除活性氧、自由基以保護細胞膜具有十分重要的作用[29]。圖6表明，2種類型的番茄果實的SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在貯藏第7天時達到峰值，此后活性不斷下降。在整個貯藏周期，與WT相比，gib-3型番茄果實的SOD和CAT活性較低。在本研究中，gib-3的LOX活性顯著高于WT，加速了膜磷脂過氧化反應的進程，產(chǎn)生了大量自由基；且gib-3的SOD和CAT活性顯著低于WT型，使得果實內(nèi)自由基清除系統(tǒng)無法清除大量累積的活性氧和自由基，導致gib-3番茄果實不斷遭受氧化損傷。因此，GA缺失會導致番茄果實SOD和CAT活性的降低，不利于活性氧和自由基的清除，導致其在番茄果實內(nèi)不斷積累，增大了番茄果實遭受氧化損傷的程度，進而使其抗冷性降低。

圖6 赤霉素缺失對番茄果實SOD活性(a)和CAT活性(b)的影響

2.7 赤霉素缺失對番茄果實抗逆相關酶活性的影響

PAL是苯丙氨酸生物合成途徑中十分重要的酶，對苯丙氨酸的生物合成起著重要的調(diào)節(jié)作用。低溫脅迫會刺激PAL活性上升，促進苯丙氨酸的合成，提高植物的抗寒性[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫引起的PAL活性增加，可以產(chǎn)生大量苯丙烷代謝物，避免番茄果實遭受光損傷，減輕低溫引起的氧化損傷，從而提高果實的抗冷能力[31-32]。本研究中，低溫貯藏時，番茄果實的PAL活性受到誘導，故貯藏前期活性不斷增加，后期降低。由圖7-a可知，gib-3型番茄果實PAL活性顯著低于WT(P<0.05)，2種番茄果實的PAL活性在貯藏前期呈現(xiàn)出上升趨勢，第21天達到峰值，此后活性下降。貯藏21 d，WT型PAL活性為74.97 U/g，gib-3型番茄果實PAL活性為45.29 U/g，比WT低39.59%。另外，本研究中關于番茄果實抗氧化相關酶的生理指標顯示，gib-3型番茄果實的SOD和CAT活性較低(圖6)，不利于清除番茄果實內(nèi)的活性氧和自由基；而gib-3型番茄果實中較低活性的PAL也無法減輕低溫引起的氧化損傷。以上結(jié)果表明，GA缺失會引起番茄果實內(nèi)PAL活性降低，加重番茄果實光損傷和氧化損傷的程度。

圖7 赤霉素缺失對番茄果實PAL活性(a)和GST活性(b)的影響

GST是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，能清除過多的氧化物，保護細胞膜的完整性，增強植物對低溫脅迫的抵抗能力[33]。GST作為一種重要的解毒酶，能夠減輕活性氧引起的氧化損傷，在生物和非生物應激反應中具有舉足輕重的地位[34]。如圖7-b所示，gib-3番茄果實的GST活性顯著低于WT型(P<0.05)。在整個貯藏周期，2種番茄果實GST活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。其中WT型GST的活性在21 d達到峰值，此后緩緩下降；而gib-3型番茄果實GST活性在貯藏14 d就達到峰值，在后續(xù)的貯藏時期快速下降，但在14 d時仍比同期WT型的GST活性低8.52%。這表明，GA缺失會導致番茄果實GST活性降低，不利于清除果實內(nèi)積累的活性氧和自由基，會加重番茄果實的氧化損傷，從而降低番茄果實的抗冷能力。

3 結(jié)論

研究表明，GA缺失加重了番茄果實的冷害癥狀，增大番茄果實冷害指數(shù)，且無法維持細胞微觀結(jié)構的完整性。另外，GA缺失使番茄果實的MDA含量、離子滲透率升高，促進細胞膜磷脂相關酶PLD和LOX、細胞壁降解相關酶PG和PME活性增強，進而破壞細胞膜和細胞壁的完整性；且使細胞抗氧化相關酶SOD和CAT、抗逆相關酶PAL和GST活性減弱，降低清除細胞內(nèi)積累的活性氧和自由基的能力，使番茄果實不斷遭受氧化損傷，降低番茄果實的抗冷性。因此，GA缺失型的番茄果實抗冷能力嚴重降低，進一步說明赤霉素在采后番茄抗冷調(diào)控中發(fā)揮了十分重要的作用。