楊金罡 郭廣國 姚淑娟 范治平 趙燕娜 王利平 李 光

(1.聊城大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，山東 聊城 252059；2.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059)

0 引言

自20世紀(jì)60年代英國學(xué)者Bangham等首次將磷脂分子分散在水中進(jìn)行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體以來[1]，載藥體系(Drug delivery systems，DDS)的研究成為了生物醫(yī)學(xué)、醫(yī)療衛(wèi)生和制藥工業(yè)的研究熱點(diǎn)[2-4].近年來，隨著對納米藥物載體的深入研究，環(huán)境響應(yīng)型無機(jī)-有機(jī)復(fù)合納米粒子在藥物傳遞系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用，這種智能型納米藥物載體具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，其不僅可以有效地提高疏水性藥物的溶解性和化學(xué)穩(wěn)定性，而且可以隨著生理環(huán)境的變化(如 pH 和溫度)進(jìn)行控制釋放，實(shí)現(xiàn)藥物在病變部位的靶向性，從而提高藥效，減小其對正常組織的毒副作用[5-7].

介孔分子篩SBA-15由于其具有良好的生物相容性，水熱穩(wěn)定性，吸附性能和低毒性，以及巨大的比表面和孔容積可以有效提高藥物裝載能力，其表面含有豐富的硅羥基，可以通過物理、化學(xué)的方法進(jìn)行表面修飾引入功能性分子，使形成具有環(huán)境響應(yīng)型的介孔納米復(fù)合材料[8-10].原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法具有適用單體廣泛，可精確控制分子量及分子量分布等優(yōu)點(diǎn)，從而成為無機(jī)材料表面接枝聚合物的有效方法[11-13].傳統(tǒng)的ATRP體系存在金屬離子(主要是銅離子和鐵離子)在反應(yīng)產(chǎn)物中難以除去，從而導(dǎo)致聚合物老化的加速，且銅鹽具有一定的生物毒性，從而限制了材料在生物醫(yī)用和電子等領(lǐng)域的應(yīng)用.電子轉(zhuǎn)移活化再生催化劑原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ARGET-ATRP)雖使得反應(yīng)產(chǎn)物中的金屬離子含量降到ppm級，但仍然沒有除盡金屬離子[14-16].2014年Hawher等人第一次報道了以10-苯基吩噻嗪(PTH)為 催化劑的無金屬催化ATRP[17]，使得ATRP體系徹底避免了金屬離子在聚合物中的殘留，拓寬了ATRP產(chǎn)物的應(yīng)用范圍.

本研究通過無金屬ATRP聚合，在SBA-15孔道內(nèi)接枝了溫敏性聚合物PNIPAM，制備了以SBA-15介孔分子篩為儲存藥物的 “倉庫”，以接枝于孔道內(nèi)的溫敏性PNIPAM作為控制釋放藥物“閥門”的溫敏性藥物控釋載體，并對藥物載體的藥物裝載量和在不同的溫度下的釋放行為進(jìn)行了研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料及試劑

10-苯基吩噻嗪(PTH)[17]和介孔分子篩SBA-15[18]根據(jù)文獻(xiàn)合成，SBA-15的N2吸附-解吸等溫線和孔徑分布曲線如圖1所示，孔徑分布比較均勻，大多數(shù)粒子的孔徑為13.24 nm.3-氨基丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)劑(KH550)(上海阿拉丁生化科技有限公司)，2-溴異丁酸乙酯(EBiB)(阿拉丁試劑)，2-溴代異丁酰溴(BIBB)(阿拉丁試劑)，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，以上試劑均為分析純.

1.2 測試分析

采用美國Nicolet IR-100紅外光譜儀測定產(chǎn)物的特征吸收峰；采用日本JEOL的JEM-1400透射電鏡(TEM)進(jìn)行對樣品進(jìn)行觀察，先將樣品分散于乙醇中，滴在銅網(wǎng)上干燥后進(jìn)行.用MERLIN Compact場發(fā)射掃描電鏡對樣品形貌進(jìn)行觀測.用德國耐馳STA449C同步熱分析儀測定產(chǎn)物隨著溫度的增加其熱失重變化.采用UV-2200(北京，北分瑞利)紫外-可見分光光度計在367 nm處監(jiān)測槲皮素在不同PBS中的釋放，波長精度為0.25 nm.用Belsorp-Max 低溫物理吸附儀，在液氮溫度下測試樣品對氮?dú)獾奈?脫附等溫線，樣品在測試前先在120 ℃的真空條件下脫氣.細(xì)胞毒性分析測試在Multiskan 1530型酶標(biāo)儀上進(jìn)行.

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 10-苯基吩噻嗪(PTH)的合成[17]. 將叔丁醇鈉(134 mg，1.4 mmol)，吩噻嗪(199 mg，1 mmol)，Rphos Brecat(14 mg，0.02 mmol)，Ruphos(8 mg，0.02 mmol)，1 mL 1,4-二氧六環(huán)，143 μL氯苯依次加入單口瓶中，磁力攪拌混合均勻后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下110 ℃加熱攪拌6 h.反應(yīng)完后冷卻至室溫，加入30 mL CH2Cl2稀釋后用等量水萃取，取下層墨綠色和黑色物質(zhì)用飽和食鹽水萃取，取下層墨綠色有機(jī)相用無水MgSO4干燥，遮光存放，然后用色譜柱分離純化(5%乙酸乙酯/正己烷)，所得產(chǎn)物減壓蒸餾，室溫真空干燥，得白色粉末狀產(chǎn)物PTH.

1.3.2 SBA-15介孔分子篩的氨基化. 將SBA-15(0.5 g)，KH-550(2 mL)，甲苯(10 mL)依次加入圓底燒瓶中，室溫下磁力攪拌均勻后，于90℃加熱攪拌10 h.反應(yīng)完后冷卻至室溫，離心分離，40 ℃真空干燥.將干燥產(chǎn)物于索氏提取器中抽提12 h，去除吸附在無機(jī)粒子表面的KH550，抽提后的產(chǎn)物40℃真空干燥，得氨基化產(chǎn)物SBA-15-NH2.

1.3.3 SBA-15-NH2的溴代. 將SBA-15-NH2(0.5 g)和四氫呋喃(THF)(6 mL)加入圓底燒瓶中，室溫磁力攪拌15 min，使其分散均勻，再加入三乙胺(2.5 mL)，冰水浴條件下用恒壓滴液漏斗滴加四氫呋喃(4 mL)和2-溴異丁酰溴(4 mL)的混合溶液，冰水浴繼續(xù)反應(yīng)24 h.反應(yīng)結(jié)束后依次用水和乙醇洗至近中性，35℃真空干燥，得SBA-15負(fù)載的溴代引發(fā)劑SBA-15-Br.

1.3.3 SBA-15-g-PNIPAM的制備. 將SBA-15-Br(0.10 g)，N-異丙基丙烯酰胺(2.30 g，9.94 mmol)，PTH(1.87 mg，0.0070 mmol)，2-溴異丁酸乙酯(0.01 mL，0.07mmol)依次加入圓底燒瓶中，再加入2 mL乙醇與水的混合液(V乙醇∶V水=4∶1)，充放氮?dú)馊?，室溫攪?0 min，使其分散均勻后，再用紫外燈于365 nm下照射4 h.反應(yīng)結(jié)束后，用12 mL乙醇與水的混合液(V乙醇∶V水=4∶1)將聚合產(chǎn)物稀釋后離心分離.上清液(含PNIPAM均聚物)用冷石油醚沉淀后室溫真空干燥；下層沉淀干燥完全后用THF索氏抽提以去除吸附在SBA-15表面的均聚物，得SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料.

1.3.4 細(xì)胞毒性分析. 根據(jù)ISO 10993-5標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)[19]，通過MTT法測定SBA-15-g-PNIPAM的提取液，評價SBA-15-g-PNIPAM的體外細(xì)胞毒性.將細(xì)胞(8×103個L929細(xì)胞/孔)接種于96孔板中,在補(bǔ)充有 10% PBS 和 1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中、5% CO2氛圍中37 ℃孵育24 h，用含有SBA-15-g-PNIPAM的培養(yǎng)基(100 μL) 替換原培養(yǎng)基，并在 37 ℃下 5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)1、2、3 d，加入20 μL MTT溶液( 5 mg mL-1in PBS)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)溶液,每孔加入150 μL DMSO，振搖 5 min 以保證藍(lán)色晶體被充分溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm處測定各孔的吸光度值，計算細(xì)胞存活率，每組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以相對于空白對照數(shù)據(jù)的百分比表示. 每組用6個樣本進(jìn)行測試.

1.3.5 槲皮素的負(fù)載與釋放. 將SBA-15-g-PNIPAM(0.02 g)與槲皮素(Qu)(0.02 g)加入到1 mL的乙醇中，室溫攪拌直至溶劑完全蒸發(fā).然后將粉末狀負(fù)載產(chǎn)品用透析袋封住口放于50 mL蒸餾水中洗滌3次，每次浸泡1 h，即得負(fù)載產(chǎn)物SBA-15-g-PNIPAM-Qu.

取2份1 mg藥物負(fù)載產(chǎn)物SBA-15-g-PNIPAM-Qu于2個透析袋中，各加入1 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，然后分別放入裝有99 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液的磨口錐形瓶中，分別標(biāo)記為1號和2號.1號置于20 ℃搖床恒溫釋放，2號置于37 ℃搖床恒溫釋放，定時取樣3 mL，并及時補(bǔ)液，每隔12 h進(jìn)行換液，測量其吸光度.槲皮素的負(fù)載與釋放示意圖如圖2所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 FT-IR分析

圖3是SBA-15(a)，SBA-15-NH2(b)，SBA-15-Br(c)和SBA-15-g-PNIPAM(d)的紅外光圖譜.由圖3a可以看出，在1085 cm-1處有一強(qiáng)吸收峰，為SBA-15介孔分子篩的特征吸收峰Si-O-Si的伸縮振動峰；與KH550反應(yīng)以后(圖3b)，在2930 cm-1處出現(xiàn)了亞甲基的吸收峰，在1568 cm-1處的吸收峰為N-H鍵的非對稱彎曲振動峰，說明KH550已成功負(fù)載到SBA-15介孔分子篩的表面；與2-溴代異丁酰溴反應(yīng)以后，如圖3(c)，在1661 cm-1處出現(xiàn)了酰胺CONH中C=O的特征吸收峰，可歸屬為SBA-15-NH2末端氨基酰溴化后的C=O的伸縮振動吸收峰，由此斷定介孔分子篩溴代過程成功；SBA-Br表面引發(fā)NIPAM聚合后，如圖3(d)，1661 cm-1處的酰胺CONH中C=O的特征吸收峰相比SBA-Br增強(qiáng)，2850-3000 cm-1處的C-H鍵的吸收峰也明顯增強(qiáng)，說明SBA-15表面成功接枝了聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM).

2.2 形貌分析

圖4分別是SBA-15(a)的透射電鏡(TEM)圖片，SBA-15(b)和SBA-15-g-PNIPAM(c)的掃描電鏡(SEM)圖片.由圖4(a)可看出，SBA-15介孔分子篩具有一定長度且排列有序的介孔孔道結(jié)構(gòu)，其有序性，規(guī)整性比較好；由圖4(b)可以發(fā)現(xiàn) SBA-15 介孔分子篩的顆粒外貌呈蓮藕狀，表面細(xì)微的凹槽清晰可見，凹面結(jié)構(gòu)在催化以及吸附反應(yīng)中會增加SBA-15 對反應(yīng)物或者擴(kuò)散介質(zhì)的吸附能，這也是 SBA-15 可以作為各類藥物的載體的重要原因.接枝PNIPAM后，如圖4(c)，SBA-15介孔分子篩的外觀形貌并沒有因?yàn)榻又酆衔锏囊攵l(fā)生根本性的變化，仍呈蓮藕狀，孔狀結(jié)構(gòu)依稀可見，說明聚合物的接枝對SBA-15的孔道結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生破壞，屬于孔內(nèi)接枝.

2.3 熱失重分析(TGA)

圖5為SBA-15和SBA-15-g-PNIPAM的TGA曲線(N2氛圍).由TGA曲線可以計算出SBA-15在室溫-800 ℃區(qū)間的熱失重為7.0 %，SBA-15-g-PNIPAM在室溫-800 ℃區(qū)間的熱失重為32.2 %，經(jīng)計算可知二者的熱失重之差為25.2 %，二者的熱失重之差主要是由SBA-15表面的有機(jī)物分解引起的，但因?yàn)镾BA-15表面的有機(jī)物在加熱過程中可能碳化，不會完全失去，因此SBA-15表面的有機(jī)物含量應(yīng)該會稍大于25.2 %，熱失重結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了SBA-15介孔分子篩可通過表面引發(fā)進(jìn)行活性自由基聚合.

2.4 溫度敏感性分析

圖6是SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料分別在20 ℃水和40 ℃水中的分散性.從圖中可以看出，SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料在20 ℃的水中呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，分散性良好，在40 ℃水中則呈聚集狀出現(xiàn)在底部，上液面澄清.這是由于SBA-15表面接枝的溫敏性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的臨界相轉(zhuǎn)變溫度大約在32 ℃，當(dāng)溫度低于32 ℃時，整個聚合物網(wǎng)絡(luò)處于伸展的狀態(tài)，有利于聚合物的分散，當(dāng)溫度高于32 ℃時，整個聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)處于收縮的狀態(tài)，不利于其分散.

進(jìn)一步用UV-vis全譜掃描不同溫度下溶液的透過率來檢測溶液的分散度(圖7)，結(jié)果顯示，SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料在40 ℃水中的透過率明顯高于在20 ℃水中的透過率，說明復(fù)合材料在20 ℃的水中呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，而在40 ℃水中則呈聚集狀出現(xiàn)在底部，上液面澄清，這與圖6的結(jié)果相佐證.

圖8為SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料分別在20 ℃水和40 ℃水中的的粒度分布曲線.從圖中可以看出，在20 ℃水中的粒徑在141.77 nm左右，在40 ℃水中的粒徑在341.99 nm左右，隨著溫度的升高，粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，同樣進(jìn)一步驗(yàn)證了SBA-15-g-PNIPAM復(fù)合材料在20 ℃的水中分散性好，而在40 ℃水中則呈聚集狀，導(dǎo)致復(fù)合材料粒度增大，顯示了良好的溫度敏感性.

2.5 藥物釋放曲線的分析

圖9為SBA-15-g-PNIPAM負(fù)載槲皮素(SBA-15-g-PNIPAM-Qu)后，在pH=7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中的釋放曲線，由于SBA-15表面的接枝聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)具有溫度敏感性，其臨界相轉(zhuǎn)變溫度(LCST)在32 ℃左右，因此我們選擇在20 ℃和37 ℃兩種溫度下進(jìn)行槲皮素的釋放.如圖9中槲皮素在20 ℃磷酸鹽緩沖溶液中的釋放曲線，當(dāng)體系所處溫度低于其臨界相轉(zhuǎn)變溫度(LCST=32 ℃)時，SBA-15-g-PNIPAM-Qu中的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物呈現(xiàn)親水傾向，整個聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)處于伸展的狀態(tài)，有利于槲皮素的釋放，且隨著時間的增長，釋放率慢慢增加，在96 h時釋放曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，釋放率達(dá)到97.36 %，此后釋放率呈現(xiàn)平臺形式，在120 h時達(dá)到釋放率為98.53 %的最大值；而當(dāng)溫度高于其臨界相轉(zhuǎn)變溫度時(37 ℃)，槲皮素的釋放率曲線近乎一條直線，保持在非常低的釋放率，釋放率在5.95 %-11.20 %之間.這是由于溫度高于其臨界相轉(zhuǎn)變溫度時，聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)處于收縮狀態(tài)，封堵住了介孔分子篩的孔道，不利于槲皮素的釋放.由此可得出通過PNIPAM功能化的SBA-15介孔材料能夠?qū)崿F(xiàn)藥物劑量的控制釋放，有望應(yīng)用于藥物控釋載體領(lǐng)域.

2.6 生物相容性分析

采用 MTT 法即細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評價SBA-15-g-PNIPAM的生物相容性.圖10為L929細(xì)胞毒性定量評價結(jié)果.第1天和第2天，細(xì)胞存活率分別為90.01 %和95.32 %，第3天，SBA-15-g-PNIPAM對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性完全消失.相對生長速率(RGR)的值證實(shí)了SBA-SBA-15-g-PNIPAM具有良好的生物相容性，充分滿足后續(xù)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的要求.

3 結(jié)論

本文以SBA-15介孔分子篩為載體，BIBB修飾后采用無金屬ATRP聚合法制備了SBA-15-g-PNIPAM溫敏型的有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料，進(jìn)一步以抗癌藥物槲皮素作為藥物模型分子，對其進(jìn)行槲皮素的藥物負(fù)載，通過TEM、SEM、紫外、紅外等表征方法進(jìn)行了表征，并研究其不同溫度下的槲皮素控釋行為.研究結(jié)果表明，溫敏性功能單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)成功接枝到了介孔分子篩SBA-15的表面，且可根據(jù)臨界相變點(diǎn)(LCST)對藥物進(jìn)行控制釋放，成功制備出了溫度控釋型的智能高分子材料，可有望應(yīng)用于醫(yī)學(xué)藥物控釋領(lǐng)域.