周麗霞,曹紅星

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 文昌 571339)

當(dāng)植物受到低溫、干旱及鹽堿等非生物逆境脅迫時(shí),細(xì)胞會發(fā)生一系列的基因調(diào)控,產(chǎn)生一系列的逆境響應(yīng)機(jī)制來適應(yīng)逆境[1]。轉(zhuǎn)錄因子在基因調(diào)控過程中起到效應(yīng)基因開關(guān)的作用,常見的轉(zhuǎn)錄因子,如WRKY、AP2、bZIP及NAC等[2-4],都在植物逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮調(diào)控作用,其中,NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物對逆境的響應(yīng)過程。NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端存在1個(gè)比較保守的NAC結(jié)構(gòu)域,其C端有1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域,當(dāng)接收到逆境脅迫信號后,NAC通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域來調(diào)控下游基因的表達(dá)[5]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子最初是從矮牽牛分生組織中分離出來的[6],當(dāng)缺少該基因時(shí),葉片無法正常發(fā)育。近年來,隨著對NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能的不斷挖掘,發(fā)現(xiàn)NAC在植物生長發(fā)育、代謝衰老、植物對抗生物及非生物脅迫等多方面都起到表達(dá)調(diào)控的作用,如Kusano等[7]研究發(fā)現(xiàn)NAC在水稻根、莖和花的發(fā)育早期及水稻成熟韌皮部的維管束組織中均有所表達(dá)。Guo等[8]研究發(fā)現(xiàn)AtNAC基因在衰老葉片中的表達(dá)量上調(diào),且過表達(dá)的AtNAC基因會加速葉片的衰老。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)當(dāng)水稻受稻瘟菌侵染后,28個(gè)OsNAC基因的表達(dá)量上調(diào),19個(gè)OsNAC基因的表達(dá)量下調(diào)。Ochiai等[10]在水稻中篩選出1個(gè)NAC基因Boronexcesstolerant1,該基因可以負(fù)調(diào)控水稻的耐硼毒性。Yokotani[11]發(fā)現(xiàn)水稻中至少有5個(gè)NAC基因在干旱及鹽脅迫中的表達(dá)量上調(diào),SNAC1基因的過量表達(dá)會促進(jìn)水稻葉片氣孔的關(guān)閉,減少水分流失,提高抗旱能力。Xue等[12]通過轉(zhuǎn)基因克隆小麥的TaNAC基因,發(fā)現(xiàn)該基因在干旱和低溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào),以提高小麥對環(huán)境的抗逆性。孫麗娟等[13]通過分析巨桉的基因EgrNAC1在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)該基因在上述3種非生物脅迫下的表達(dá)量均上調(diào),該基因?qū)@3種脅迫均會產(chǎn)生響應(yīng)。

我國從馬來西亞、印度尼西亞等油棕傳統(tǒng)種植區(qū)引進(jìn)油棕試種近90年,主要種植在海南、廣西等熱區(qū)。近年來,隨著棕櫚油消費(fèi)量的增大,油棕的種植面積急需擴(kuò)大,但我國冬季的低溫天氣嚴(yán)重限制了油棕的擴(kuò)大種植,低溫是限制我國油棕產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一,研究油棕EgNAC33基因的表達(dá)特征和功能,對油棕的抗逆尤其是抗寒育種具有重要意義。目前,關(guān)于油棕NAC基因受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的研究鮮有報(bào)道。筆者借助分子技術(shù),克隆了油棕的EgNAC33基因,應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析了其序列結(jié)構(gòu)特征,通過熒光定量PCR方法檢測了該基因在低溫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)的規(guī)律,同時(shí)初步探索了此基因?qū)Ω珊导案啕}脅迫的響應(yīng)，旨在為進(jìn)一步的基因功能鑒定工作提供試驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為油棕分子輔助育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油棕材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所油棕品種試種示范園。選取9株同一批培育、植株大小相近,長勢良好、莖高約45 cm的幼苗,將其分為3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為3株,放入可控植物三色光培養(yǎng)箱中,進(jìn)行8 ℃低溫(光照14 h/黑暗10 h)處理,分別在處理后1、4、8、24和48 h時(shí)進(jìn)行葉片采樣；以28 ℃室外生長條件下的幼苗為對照組。分別用7、5、3、2和1 d不澆水的植株作為干旱處理組；以正常澆水組為對照組，進(jìn)行葉片采樣。高鹽處理：將油棕幼苗置于不同塑料容器內(nèi),處理組容器中保持植株栽培盆1/2高度的300 mmol/L NaCl溶液,對照組則用清水保持同樣液面高度,并分別在處理后0、4、12、24、48及72 h時(shí)進(jìn)行葉片采樣。取樣樣品均為幼苗的中間嫩葉,用液氮冷凍,用于RNA的提取。

主要試劑:大腸桿菌Escherichiacoli5α為湖南大學(xué)分子育種實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、Taq DNA polymerase、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自?？诃偵饺R客(海南)科技服務(wù)中心；克隆載體pGEM-T Easy Vector購自Promega公司； RT-PCR試劑盒、RACE試劑盒購自Invitrogen公司；熒光定量試劑盒[FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)]購自羅氏公司；引物合成及測序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

主要儀器設(shè)備: Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、SYNGENE GBOXHR 凝膠成像分析系統(tǒng)、三色光培養(yǎng)箱(LED-30HL1,美國)、超速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810 R型,德國)、超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo Nanodrop 2000)。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法[14]提取油棕嫩葉的RNA。稱取約2 g油棕嫩葉,利用液氮將其研磨至粉末狀,置于2 mL EP離心管中,向管中加入1 mL RNA提取液,充分振蕩并靜置10 min；再向其中加入0.2 mL氯仿,充分振蕩混勻后靜置7 min；然后在4 ℃超速冷凍離心機(jī)中以10000 r/min離心10 min;吸取600 μL上清液至新的1.5 mL無RNase的離心管中,加入等體積冰凍的異丙醇,輕輕搖勻后冰上放置10 min,在4 ℃超速冷凍離心機(jī)上以10000 r/min離心10 min;去上清,加入1 mL 75%乙醇,在4 ℃超速冷凍離心機(jī)上以8000 r/min離心5 min;去上清,在超凈工作臺上靜置至酒精完全揮發(fā),加入20 μL RNase-free水,用槍頭吹打混勻得RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性,利用超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度及濃度。

取1 μL上述檢測過的質(zhì)量和純度較好的RNA,應(yīng)用?？诃偵饺R客(海南)科技服務(wù)中心的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.3 EgNAC33基因的克隆和序列分析

首先,從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得NAC基因的編碼序列,通過Clustal X進(jìn)行多序列比對,根據(jù)序列的保守性設(shè)計(jì)兼并性引物NAC-F:5′-GGACAAAGAATTGCTTAATGC-3′；NAC-R:5′-CACAACAGCTGAACTTGATATC-3′。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用獲得的片段以T載體法克隆PCR產(chǎn)物,將陽性克隆送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

根據(jù)RT-PCR片段的序列測定結(jié)果,合成RACE-PCR所需的特異引物GSP1:5′-CTGGTTTCCGTTTCCATCCC-3′；GSP2:5′-CGAACCGAGCAGCCAACA-3′,分別用于克隆cDNA的5′端序列和3′端序列,具體步驟均按RACE試劑盒說明書執(zhí)行；PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)T載體克隆、測序，并與已克隆的NAC基因編碼拼接,從而獲得全長cDNA序列。以拼接得到的基因全長cDNA設(shè)計(jì)引物NAC-F:5′-CTCAAAGATTAGAGGCTCCCC-3′；NAC-R:5′-AGTGATAAGCTCCTCGTCGGT-3′,通過PCR擴(kuò)增和測序,驗(yàn)證所獲基因全長的準(zhǔn)確性。

1.4 EgNAC33基因的表達(dá)分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察EgNAC33基因在油棕葉片中的表達(dá)量變化情況,以Actin1為內(nèi)參基因,引物為Actin1-F:5′-GTTGTCGCTCCACCCG-3′；Actin1-R:5′-GCAGGACCACATTCATCATA-3′[15]。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)EgNAC33基因的定量引物EgNAC33-F:5′-ACGCTTTCCGCGACACTG-3′；EgNAC33-R:5′-CCGGAGTGCCGTGAACAA-3′。定量PCR分別進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù),反應(yīng)體系為10 μL:5 μL FastStart Universal SYBR Green Master緩沖液、0.5 μL上引物(10 μmol/L)、0.5 μL下引物(10 μmol/L)、0.2 μL Rox、1 μL cDNA模板、2.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s,60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸20 s,共35個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SMART軟件預(yù)測EgNAC33的保守結(jié)構(gòu)域；通過NCBI網(wǎng)站blast油棕EgNAC33與其他植物NAC蛋白序列的同源性；同時(shí)應(yīng)用MEGA 6.06軟件構(gòu)建油棕與其他植物NAC蛋白的進(jìn)化樹,分析進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 EgNAC33基因的克隆與測序分析

在RACE后通過拼接、驗(yàn)證和再測序,獲得了1條NAC的全長cDNA序列,該序列大小約為1952 bp,含1個(gè)長約735 bp的開放閱讀框,可編碼245個(gè)氨基酸殘基。在NCBI網(wǎng)站上blast (http://blast.ncbi.nim.nih.gov/blast)對比后,發(fā)現(xiàn)該基因靠近N端的位置具有NAC保守結(jié)構(gòu)域。將EgNAC33基因編碼的蛋白序列與其他植物的同源蛋白序列進(jìn)行比對,結(jié)果如圖1所示,在不同植物間蛋白序列N端約11個(gè)氨基酸的同源性較低,第47～143氨基酸序列相對保守。通過分析不同植物間NAC基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),發(fā)現(xiàn)大致分為2個(gè)亞族,其中油棕NAC33與CnNAC同源蛋白的親緣關(guān)系最近,其同源氨基酸相似度高達(dá)93%,且與椰棗和檳榔同屬1個(gè)亞族,該亞族中的植物均為木本植物；而擬南芥、大豆和花生作為草本植物聚類在一起,與其他木本植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在進(jìn)化上,EgNAC33與CnNAC的親緣關(guān)系最近。

At為擬南芥；Cn為椰子；Gm為大豆；Os為水稻；Dp為椰棗；Ac為檳榔。圖1 油棕EgNAC33蛋白序列與其他植物同源蛋白序列的比對

圖2 不同植物間NAC基因的進(jìn)化樹分析

2.2 在低溫脅迫下EgNAC33基因的表達(dá)

由圖3可知,油棕幼苗經(jīng)過8 ℃低溫處理后,EgNAC33在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)明顯受到低溫誘導(dǎo),且在各低溫脅迫時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量均比對照組的表達(dá)量高,顯示該基因受到了低溫脅迫的誘導(dǎo)。其中在低溫脅迫的0～8 h期間,EgNAC33的表達(dá)量逐漸變大,在8 h時(shí)其相對表達(dá)量達(dá)到最高水平；隨著低溫脅迫時(shí)間的增加,其表達(dá)量先降低,然后又增加；從整體上看,在8 ℃低溫條件下,EgNAC33的表達(dá)在不同處理時(shí)間下均被強(qiáng)烈誘導(dǎo),與對照相比,該基因的表達(dá)量在1 h時(shí)即被誘導(dǎo)增加了4.42倍,在4 h時(shí)增加了7.83倍,在8 h時(shí)增加了9.88倍,在24 h時(shí)增加了2.91倍,在48 h時(shí)增加了5.98倍。由此可見,在不同的脅迫時(shí)間段內(nèi),EgNAC33基因的表達(dá)量存在一定的波動性。這說明EgNAC33基因參與了調(diào)控油棕的抗寒響應(yīng),但又體現(xiàn)了其對低溫脅迫響應(yīng)調(diào)控的復(fù)雜性,一方面該基因的表達(dá)與溫度有關(guān),另一方面,它還可能受到植物其他生理因子的影響[16]。

圖3 在低溫脅迫下EgNAC33基因的相對表達(dá)量

2.3 在高鹽脅迫下EgNAC33基因的表達(dá)

從圖4可以看出：油棕幼苗經(jīng)過300 mmol/L NaCl溶液處理后,EgNAC33在各脅迫時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量明顯受到高鹽誘導(dǎo),且在各脅迫時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量均高于對照組的表達(dá)量,初步表明該基因受到了高鹽脅迫的誘導(dǎo)。具體來說，在脅迫的0～24 h期間,EgNAC33的表達(dá)量逐漸變大,其中,在24 h時(shí)的相對表達(dá)量達(dá)到最高水平,高達(dá)4.3倍；隨著脅迫時(shí)間的延長,其表達(dá)量逐漸降低。由此可見,EgNAC33基因?qū)Ω啕}脅迫做出了應(yīng)答,參與了調(diào)控油棕的耐鹽機(jī)制。

圖4 在高鹽脅迫下EgNAC33基因的相對表達(dá)量

2.4 在干旱脅迫下EgNAC33基因的表達(dá)

從圖5可以看出,在干旱脅迫條件下,在各時(shí)間點(diǎn)EgNAC33基因的相對表達(dá)量與對照組相比無明顯差異。推測EgNAC33不能被干旱脅迫誘導(dǎo),該基因不參與干旱逆境的應(yīng)答信號途徑。

圖5 在干旱脅迫下EgNAC33基因的相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

NAC基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用,而且也參與植物對干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫的抗逆反應(yīng),其中有20%～25%的家族成員參與至少1種以上逆境因子的響應(yīng)[17]。本研究通過分析EgNAC33蛋白的生物信息學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)EgNAC33基因的長度為1952 bp,含有1個(gè)長約735 bp的開放閱讀框,編碼245個(gè)氨基酸；EgNAC33蛋白質(zhì)的N端具有NAC保守結(jié)構(gòu)域；在系統(tǒng)進(jìn)化上,該基因與椰子NAC的親緣關(guān)系最近,且與椰棗和檳榔同屬一個(gè)亞族。該結(jié)果表明棕櫚科植物中NAC蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性。

很多研究表明,NAC基因受多種逆境因子的影響,并能啟動多個(gè)逆境反應(yīng)調(diào)控途徑,參與植物的多種抗逆響應(yīng)，例如：棉花的GhSNAC5和GhSNAC8基因會不同程度地被高鹽、干旱及黃萎病脅迫誘導(dǎo)[18];番茄的TNAC基因同時(shí)受高鹽和低溫逆境的誘導(dǎo)[19];大豆的GmNAC基因受鹽脅迫的誘導(dǎo)[21]。本研究發(fā)現(xiàn),EgNAC33對干旱脅迫沒有明顯響應(yīng),但對低溫和高鹽脅迫均表現(xiàn)出典型的誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng),且在不同處理時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn),同時(shí)由EgNAC33介導(dǎo)的冷脅迫及高鹽脅迫響應(yīng)與干旱脅迫響應(yīng)途徑?jīng)]有交叉反應(yīng)。

基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程。本研究只初步考察了油棕受到低溫、高鹽及干旱脅迫時(shí)EgNAC33基因的表達(dá)量變化,雖然可以為研究NAC基因家族調(diào)控油棕抗逆反應(yīng)機(jī)制提供一定的試驗(yàn)依據(jù),但對該基因家族的具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在油棕對抗外界脅迫時(shí)發(fā)揮的具體作用還需更深入的探索。