周 影,魏啟舜,王 琳,郭成寶,趙荷娟,文蔚明

(江蘇丘陵地區(qū)南京農業(yè)科學研究所,江蘇 南京 210046)

氨基酸是構建生物有機體的眾多生物活性大分子之一,也是構建生物細胞、修復組織的基礎材料[1]。肥料中的游離氨基酸能夠被植物直接吸收利用,提高肥料利用率和作物養(yǎng)分的轉化率,促進作物生長,提高施肥對象的抗病性,改善施肥作物的品質等功能,對于植物的生長有著重要的意義[2-4]。目前生產中多采用發(fā)酵菜粕[5-6]、魚粉,酸解病死畜禽[7],酶解羽毛、血液等方法獲得氨基酸液體肥,這些方法成本高,存在二次污染等風險,不利于大面積推廣應用。

羽毛作為家禽飼養(yǎng)和屠宰工業(yè)的副產物,全球每年產量達數(shù)百萬t[8],但因缺乏有效實用的轉化利用手段,大部分被作為廢棄物直接丟棄[9]。家禽羽毛屬天然角蛋白質,其粗蛋白含量高達80%以上[10-11],是一種具有潛在應用價值的蛋白質,可成為動物所需的重要蛋白來源[12-13]。水解利用羽毛蛋白質生產復合氨基酸具有潛在的經濟效益[14]。

用傳統(tǒng)的酸堿水解和高壓蒸煮的方法處理農業(yè)廢棄物存在很多弊端,因此生物發(fā)酵方法成為首選。目前已發(fā)現(xiàn)30余種微生物可用于羽毛角蛋白的降解,主要包括細菌類的芽孢桿菌屬[15-16]、真菌類的曲霉屬[17]、放線菌的鏈霉菌屬[18]。然而目前用微生物降解羽毛大多以提高酶活、生產角蛋白酶為主要目的。而通過改進發(fā)酵工藝,以提高降解液中游離氨基酸含量為目的的研究鮮見報道。

我們利用本研究室前期篩選獲得的1株能有效降解羽毛的地衣芽孢桿菌ZSZ6液體發(fā)酵降解羽毛，探究了外加碳氮源、溫度、初始pH值、裝液量、羽毛量、 接種量等不同發(fā)酵條件對其降解羽毛產游離氨基酸的影響,以期提高產物中的氨基酸含量,為畜禽養(yǎng)殖和屠宰加工廢棄物的肥料化利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 地衣芽孢桿菌菌株由江蘇丘陵地區(qū)南京農業(yè)科學研究所微生物實驗室篩選、保存。

1.1.2 羽毛 從市場上收集。經去雜、自然風干后切成1～3 cm長，備用。

1.1.3 試驗培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高壓滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離氨基酸含量的測定 采用茚三酮法(GB/TB 314─2002),并在此基礎上稍作修改。

1.2.2 羽毛降解率的測定 發(fā)酵液離心后倒掉上清液,殘渣經105 ℃烘干至恒重,計算降解率，計算公式為：羽毛降解率(%)=(底物羽毛干重-降解后殘渣干重)/底物羽毛干重×100。

1.2.3 外加碳源對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%質量分數(shù)羽毛的基礎上,分別加入1%的乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉5種碳源,以不外加碳源為對照,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.4 外加氮源對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%質量分數(shù)羽毛的基礎上,分別加入1 g/L的硝酸鈉、酵母粉、硫酸銨、蛋白胨、尿素和牛肉膏6種氮源,以不外加氮源為對照,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.5 溫度對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%質量分數(shù)的羽毛,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),分別在180 r/min+25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.6 初始pH值對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%質量分數(shù)的羽毛,調節(jié)初始pH值分別為5、6、7、8、9,裝液量50 mL /250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.7 裝液量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%質量分數(shù)的羽毛,初始pH 7.0,設置裝液量分別為50、75、100、125、150 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.8 底物羽毛量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0,裝液量125 mL/250 mL三角瓶,分別添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%質量分數(shù)的羽毛,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)96 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.9 接種量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5%質量分數(shù)的羽毛,初始pH 7.0,裝液量125 mL/250 mL三角瓶,接種量設1%、2%、3%、4%、5%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)96 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.10 降解時間對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響 按優(yōu)化后的工藝(培養(yǎng)基初始pH值7.0,裝液量125 mL/250 mL,底物羽毛量5%質量分數(shù),接種量2%體積分數(shù),發(fā)酵溫度37 ℃,離心轉速180 r/min)進行羽毛發(fā)酵培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)12 d,每天取樣測定樣品中的游離氨基酸含量,并測定羽毛降解率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應用Excel 1997-2003和SPSS 19軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 外加碳、氮源對降解羽毛產游離氨基酸的影響

有研究表明,外加碳、氮源能夠補充營養(yǎng)物質,促進細菌生長。本研究結果(圖1、圖2)顯示,外加乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛產游離氨基酸均未產生促進作用,發(fā)酵液中游離氨基酸含量均低于純羽毛的對照。外加不同氮源的處理羽毛降解情況均差于純羽毛的對照；部分降解液中游離氨基酸含量高于對照，這可能是外加氮源在發(fā)酵過程中被菌體降解產生的。分析原因,外加碳、氮源有利于菌體的生長,相較于難以利用的羽毛,地衣芽孢桿菌會優(yōu)先選擇利用外加營養(yǎng)物質，因而不產生角蛋白酶,從而影響了其對羽毛的降解,不利于游離氨基酸的產生。因此,對于地衣芽孢桿菌ZSZ6來說,培養(yǎng)基中外加碳、氮源并未能對其降解羽毛產氨基酸起到促進作用,其可以羽毛為唯一營養(yǎng)源而獲得較好的降解效果。

圖2 不同氮源對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

2.2 溫度對降解羽毛產游離氨基酸的影響

溫度是影響微生物生長及分泌代謝產物的重要影響因素。溫度過高或過低均不利于微生物的生長,進而影響羽毛降解效果[19]。本研究結果(圖3)表明,溫度對菌株降解效果的影響較為顯著。隨著降解溫度的升高,發(fā)酵液中游離氨基酸含量呈先增加后減少的趨勢。在25、30 ℃溫度下游離氨基酸含量均較低；當溫度升至35 ℃時，發(fā)酵液中游離氨基酸含量增加較多,達到1.15 g/L；當降解溫度為37 ℃時，游離氨基酸含量最高，達1.44 g/L,較35 ℃條件下提高了24.9%；當溫度升至40 ℃時，降解液中游離氨基酸含量則開始下降。上述結果說明,37 ℃的溫度可能是地衣芽孢桿菌ZSZ6的最適生長溫度,該溫度條件有利于菌體的生長,從而促進羽毛的降解,提高發(fā)酵液中游離氨基酸的含量。

圖3 溫度對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

2.3 初始pH值對降解羽毛產游離氨基酸的影響

本實驗設置5～9范圍的初始pH值,結果(圖4)顯示,發(fā)酵培養(yǎng)基過酸或過堿均不利于菌體的生長,當pH值為5時,發(fā)酵液中的游離氨基酸含量最低,僅為0.18 g/L,且羽毛降解效果最差；當pH值升至6時,氨基酸含量顯著增加,是pH 5時的4.9倍；當初始pH值為7時,產物中游離氨基酸含量最高,達1.02 g/L；在pH 8和pH 6條件下的氨基酸含量接近,但都小于pH 7下的；當pH值調節(jié)為9時,氨基酸含量降低明顯。表明,地衣芽孢桿菌ZSZ6適宜的生長pH值偏中性。

圖4 初始pH值對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

2.4 裝液量對降解羽毛產游離氨基酸的影響

裝液量的多少影響發(fā)酵液的溶氧量,對菌體的生長、代謝會產生一定的影響,直接影響到菌株的產酶活性和對羽毛角蛋白的降解,從而影響到發(fā)酵液中游離氨基酸的含量[20]。從圖5可以看出，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液中游離氨基酸含量呈先增加后減少的趨勢。具體來說：當裝液量為50～125 mL時,隨著裝液量的增加,發(fā)酵液中游離氨基酸含量升高,在裝液量為125 mL時,發(fā)酵液中游離氨基酸含量達到最大值(1.05 g/L)；當裝液量增加到150 mL時,產物中游離氨基酸含量開始下降(0.95 g/L)；當裝液量達到150 mL時,培養(yǎng)液中總溶氧量減少，不能滿足好氧細菌對氧氣的需求,從而抑制了菌體的生長與代謝。在本實驗條件下,選用125 mL/250 mL的裝液量效果最佳。

圖5 裝液量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

2.5 羽毛添加量對游離氨基酸產量的影響

在本實驗條件下,羽毛作為地衣芽孢桿菌ZSZ6降解產游離氨基酸的唯一碳、氮來源,其含量多少對整個發(fā)酵過程至關重要。圖6顯示：當?shù)孜镉鹈吭?.5%～5%時，隨羽毛量的增加產物中游離氨基酸含量逐漸增多；當羽毛含量為5%時,氨基酸含量最高,達13.15 g/L；當繼續(xù)增加底物羽毛量至6%時,產生的游離氨基酸含量開始下降；當羽毛添加量增加到7%時,氨基酸含量下降明顯。這可能是由于羽毛量過多會影響料液比,發(fā)酵液溶氧量減少,不利于菌體生長,從而影響降解效果。同時,角蛋白酶是一種誘導酶,作為誘導物的羽毛含量對菌株的發(fā)酵產酶產生影響,但過量羽毛角蛋白添加會降低菌株產酶[21],不利于羽毛的降解。

2.6 接種量對羽毛降解效果的影響

圖6不同接種量的實驗結果表明：當接種量為1%～2%時,發(fā)酵液中的游離氨基酸含量隨接種量的增加而增大；當接種量為2%時，獲得的氨基酸含量最高,為12.15 g/L；在3%和5%的接種量產物中的游離氨基酸含量相近,且僅次于2%的處理；接種量為1%和4%時獲得的游離氨基酸含量相當,且較低。說明接種量對菌株代謝產生游離氨基酸的影響并非線性關系。綜合考慮降解效果和經濟效益,采用2%的接種量用于羽毛降解產游離氨基酸最為理想。

圖6 底物量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

圖7 接種量對羽毛發(fā)酵產游離氨基酸的影響

2.7 羽毛降解時間曲線

綜合上述優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件,連續(xù)發(fā)酵12 d,每天測定發(fā)酵產物中的游離氨基酸含量及羽毛降解情況。結果(圖8)顯示,降解液中的游離氨基酸含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。具體而言，在降解第2天，發(fā)酵液中的游離氨基酸含量迅速增加；在降解第2～5天為快速增長期,產物中的游離氨基酸含量迅速增加,且增幅較大，在發(fā)酵第5天時含量達到17.51 g/L；之后產物中的氨基酸含量增速放緩,到第9天達到峰值(19.47 g/L)后開始下降；在降解第12天時,游離氨基酸的含量為15.23 g/L,比高峰值減少了4.24 g/L。究其原因，可能是隨著時間的推移,微生物降解羽毛產生的氨基酸被用于自身的生長代謝[22],且消耗的速率大于羽毛降解產氨基酸的速率。

羽毛降解率隨發(fā)酵時間的增加而不斷升高。在發(fā)酵第5天降解率即達到70%以上；在發(fā)酵第12天降解率最高,為80.8%。由圖8可知：在發(fā)酵第1天僅有少量羽毛被降解；在第2天和第3天為快速降解期,羽毛降解速率最快；之后降解速率開始下降。分析原因，可能是隨著發(fā)酵時間的延長,ZSZ6降解羽毛產生高濃度的游離氨基酸及其它代謝產物,影響角蛋白酶的分泌及活性；同時,角蛋白酶的自身水解也直接影響了羽毛的降解[14]。

圖8 發(fā)酵時間對羽毛降解率及氨基酸含量的影響

3 結論與討論

隨著人們對環(huán)境保護的重視,利用生物方法處理角蛋白類廢棄物被越來越多的研究者關注。劉艷海等[23]研究發(fā)現(xiàn),嗜熱性地衣芽孢桿菌Y6(BacilluslicheniformisY6)在最適發(fā)酵溫度55 ℃條件下72 h可降解除羽軸外的羽枝部分,所產蛋白酶為耐熱堿性蛋白酶;當解淀粉芽孢桿菌3-2以乳糖為外加碳源時發(fā)酵羽毛產氨基酸,可用于生產氨基酸復合肥料[14]；地衣芽孢桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221固體發(fā)酵廢棄羊毛產角蛋白產品,可用作飼料蛋白添加劑[24];地衣芽孢桿菌NJ-01用于分解鴿羽毛,37 ℃ 5 d鴿羽毛開始分解,在37 ℃下培養(yǎng)15 d時鴿羽毛小羽枝、羽毛梗全部分解為碎片[25]。

相較于前人的研究,本研究中地衣芽孢桿菌ZSZ6可有效降解羽毛廢棄物,且降解條件要求簡單,降解效率高,發(fā)酵可產生較高濃度的游離氨基酸。通過單因素試驗考察外加不同碳源和氮源、不同溫度、初始pH值、裝液量、底物羽毛量、接種量等對羽毛降解效果的影響，結果表明:在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0、羽毛添加量5%、裝液量125 mL/250 mL、接種量2%、發(fā)酵溫度37 ℃條件下培養(yǎng)5～9 d,發(fā)酵液中游離氨基酸含量最高,達19.47 g/L。在優(yōu)化條件下發(fā)酵5 d,產物中游離氨基酸含量即達17.51 g/L,羽毛降解率在70%以上。說明利用地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛可有效實現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖廢棄物的資源化利用,產物可用于生產氨基酸產品。