唐文武，吳秀蘭，鐘佩橋

(1.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 肇慶 526061;2.肇慶學(xué)院 食品與藥品工程學(xué)院,廣東 肇慶 526061)

bHLH (basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子是一類含有bHLH結(jié)構(gòu)域,在真核生物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子超家族[1]。bHLH結(jié)構(gòu)域一般由50～60個(gè)氨基酸組成,包括N端由10～15個(gè)堿性氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域,以及C端由約40個(gè)氨基酸組成的α螺旋-環(huán)-α螺旋區(qū)域(HLH)[2]。高等植物具有數(shù)目較多的各類bHLH轉(zhuǎn)錄因子,目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)21個(gè)亞家族的147個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[3,4],在水稻中鑒定出了22個(gè)亞家族的167個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[5],它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、花器官形成、激素應(yīng)答、次生產(chǎn)物代謝和抗逆性等方面發(fā)揮重要作用[6-8]。

白菜是重要的蔬菜作物,與擬南芥有著共同的祖先,是研究多倍體事件的經(jīng)典材料[9]。bHLH是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子,能通過(guò)調(diào)控花器官相關(guān)基因的表達(dá)而影響小孢子發(fā)育,與植物雄性不育發(fā)生密切相關(guān)。目前已在擬南芥、水稻、玉米等模式植物中發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在花藥絨氈層發(fā)育、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂，以及雄蕊發(fā)育等過(guò)程中起到重要作用,其基因突變或功能異常會(huì)引起植物雄性不育[10]。目前已在擬南芥、水稻中鑒定了AMS[11]、DYT1[12]、JAM[13]、UDT1[14]、TDR1[15]等與雄性不育相關(guān)的 bHLH基因,但在白菜中開展 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。為了深入挖掘與白菜細(xì)胞核雄性不育相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,本研究利用生物信息學(xué)方法,對(duì)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員進(jìn)行了全基因鑒定,對(duì)其bHLH結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析,并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因在可育和不育花蕾中的表達(dá)差異進(jìn)行了分析,篩選了與雄性不育相關(guān)的bHLH基因,以期為進(jìn)一步揭示白菜bHLH家族基因在雄蕊發(fā)育中的生物學(xué)功能和雄性不育應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的獲取與分析

從蕓薹屬BRAD基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)中下載白菜(B.rapa)全基因組序列(V1.5版),在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載bHLH結(jié)構(gòu)域(PF00010)的隱馬爾可夫模型序列譜,并利用HMMEMIT軟件獲取其蛋白保守序列,用此序列檢索白菜BRAD(http://brassicadb.org/brad/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；然后利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),并去除假陽(yáng)性序列,獲得白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族候選基因,用于后續(xù)分析。

1.2 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy(http://web.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)等基本理化特征。從PGDD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication)獲取基因復(fù)制及共線性分析數(shù)據(jù),利用Circos軟件對(duì)bHLH家族基因的染色體位置和共線性關(guān)系進(jìn)行可視化分析[16]。利用clustal X對(duì)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì),并利用Web Logo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)進(jìn)行可視化作圖[17]。最后利用MEGA 7程序的鄰接法構(gòu)建白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹,其Bootstrap值設(shè)為1000。

1.3 白菜bHLH家族基因的育性及組織表達(dá)特異性分析

白菜基因的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫(kù),利用白菜細(xì)胞核雄性不育兩用系中可育及不育花蕾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18],以FPKM 值作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo),篩選bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因在可育和不育花蕾中的差異表達(dá)序列,以log2倍數(shù)絕對(duì)值大于2為依據(jù)篩選差異表達(dá)的bHLH基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)bHLH結(jié)構(gòu)域PF00010的特征文件,在NCBI、BRAD的白菜數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到249個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白,按照其在BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序號(hào),分別命名為BraHLH001～BraHLH249。理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因長(zhǎng)度為1134～13231 bp,蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目介于84～1201,分子量為9.80～132.38 kDa,理論等電點(diǎn)分布在4.69～9.81范圍內(nèi)。

進(jìn)一步對(duì)249個(gè)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的bHLH結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)bHLH結(jié)構(gòu)域基序長(zhǎng)度為41～66,平均氨基酸數(shù)目為49.8。用clustal X對(duì)所有的bHLH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，然后采用WebLogo作圖，結(jié)果(圖1)顯示白菜的bHLH結(jié)構(gòu)域由50個(gè)氨基酸組成,其N端的Basic區(qū)含有植物中高度保守的His5-Glu9-Arg13序列,該序列對(duì)靶基因啟動(dòng)子上游的E-box識(shí)別結(jié)合必不可少；在C端的HLH區(qū)域,第23、49位的Leu高度保守,第39、43、46位的Leu/Ile/Val也非常保守,這些氨基酸殘基對(duì)于二聚體的形成和功能非常重要。

圖1 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的保守結(jié)構(gòu)域

2.2 白菜bHLH家族基因的染色體定位、基因復(fù)制和共線性分析

白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因的染色體定位結(jié)果(圖2)顯示,除BraHLH240、BraHLH247、BraHLH248、BraHLH249定位在scaffold上外,其余的245個(gè)基因不均勻地分布于白菜的10條染色體上，其中在A9染色體上的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因最多，達(dá)39個(gè)；其次是在A3染色體上，有33個(gè)基因；而在A8、A10染色體上分布的基因較少,分別僅含有16、14個(gè)基因;在其它6條染色體上分布有22～27個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因。

為了進(jìn)一步確定白菜bHLH基因之間的關(guān)系,以及進(jìn)化中潛在的重復(fù)事件,對(duì)249個(gè)白菜bHLH基因的旁系同源基因?qū)M(jìn)行共線性分析。結(jié)果(圖2)表明,除了49個(gè)白菜bHLH基因沒有同源重復(fù)外,其余200個(gè)bHLH基因均有對(duì)應(yīng)的旁系同源基因,但多數(shù)旁系同源基因分布在不同染色體上,該結(jié)果可能是由白菜全基因組三倍化事件引起的。

圖2 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族的共線性關(guān)系及其在染色體上的分布

2.3 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 7軟件對(duì)鑒定出的249個(gè)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的bHLH結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并以擬南芥的bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞家族分類方法作為參考。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖3)表明,白菜中249個(gè)bHLH蛋白可被分為24個(gè)亞家族，其中XⅡ、Ⅰb (2)、Ⅰa三個(gè)亞族的bHLH成員最多,分別包含29、25、23個(gè)bHLH蛋白；第Ⅲ(a+c)、Ⅲb、Ⅲ(d+e)、Ⅶ(a+b)、Ⅷa、Ⅷc、Ⅴb、X、XV共9個(gè)亞族的bHLH蛋白成員為10～19個(gè)；第Ⅱ、Ⅲf、Ⅰb(1)、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅴa、Ⅷb、IX、XI共10個(gè)亞族的bHLH成員為3～9個(gè)；而Ⅳd和Orphans亞族的成員最少,均只含有1個(gè)bHLH蛋白。

圖3 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的育性表達(dá)差異分析

基于白菜核不育兩用系中可育及不育花蕾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)249個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因在可育、不育花蕾中的表達(dá)差異性進(jìn)行了分析,結(jié)果如表1所示,共有12個(gè)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因在不育與可育花蕾中的表達(dá)量log2倍數(shù)值大于2。相較于可育花蕾,不育花蕾中有10個(gè)基因的表達(dá)量顯著下調(diào),另2個(gè)基因BraHLH191、BraHLH200的表達(dá)量顯著上升。這12個(gè)表達(dá)差異的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因,可能與雄蕊不育性狀相關(guān)。其中BraHLH034是擬南芥AMS的直系同源基因,可能參與花藥絨氈層發(fā)育以及小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控過(guò)程[11,19],而BraHLH106、BraHLH125與擬南芥的bHLH89、bHLH91為直系同源基因,通過(guò)與DYT1相互作用調(diào)控花藥發(fā)育并引起雄性不育現(xiàn)象[20]。

表1 白菜可育和不育花蕾中表達(dá)差異顯著的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因

3 小結(jié)與討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前對(duì)擬南芥、水稻等模式植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究比較深入,但對(duì)蔬菜類bHLH基因家族的研究較少。本研究利用生物信息學(xué)方法從白菜基因組中鑒定出249個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子,并發(fā)現(xiàn)其bHLH結(jié)構(gòu)域由約50個(gè)氨基酸組成,其N端的Basic區(qū)含有高度保守的H5-G9-A13序列,可與啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合;而C端第23、49位的亮氨酸高度保守,第43、46位的亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸也非常保守,這些保守位點(diǎn)與bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能密切相關(guān)。染色體定位分析結(jié)果顯示245個(gè)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因不均勻地分布于10條染色體上,多數(shù)基因有對(duì)應(yīng)的旁系同源基因。根據(jù)bHLH結(jié)構(gòu)域的特征，可將白菜的249個(gè)bHLH蛋白分為24個(gè)亞家族,比擬南芥和水稻的亞家族數(shù)目多,其中XⅡ是最大類的亞家族,包含29個(gè)bHLH成員。

在模式植物中發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子與雄性不育的形成密切相關(guān),bHLH轉(zhuǎn)錄因子會(huì)參與花藥絨氈層的發(fā)育或小孢子發(fā)育,其功能異常會(huì)引起絨氈層細(xì)胞提前或延遲降解,致使花粉形成受阻而敗育[10]。目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)DYT1[12]、AMS[11]、MYC[21]等bHLH轉(zhuǎn)錄因子在花藥絨氈層發(fā)育和小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中起到重要作用,發(fā)現(xiàn)3個(gè)JAM基因參與茉莉酸信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),并在雄蕊發(fā)育中起到負(fù)調(diào)控作用[13]。在水稻中發(fā)現(xiàn)了UDT1[22]、TDR1[23]、EAT1[24]、TIP2[25]等bHLH轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層細(xì)胞發(fā)育和程序性死亡中發(fā)揮重要作用,其功能異常也會(huì)引起雄性不育。本研究對(duì)白菜可育、不育花蕾中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)差異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示,12個(gè)白菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因在不育與可育花蕾中的表達(dá)量差異顯著。其中BraHLH034是擬南芥AMS基因的直系同源基因,可能參與花藥絨氈層發(fā)育以及小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控過(guò)程[11,19]；而BraHLH106、BraHLH125與擬南芥的bHLH89、bHLH91為直系同源基因,與DYT1相互作用從而調(diào)控花藥的發(fā)育,兩個(gè)或以上的突變體會(huì)導(dǎo)致雄性不育現(xiàn)象[20]。我們分析認(rèn)為BraHLH034、BraHLH106、BraHLH125等bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因參與雄蕊的發(fā)育過(guò)程。本研究結(jié)果為探索植物雄蕊發(fā)育的調(diào)控機(jī)理,以及探討bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物雄性不育的發(fā)生機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。