王 迪, 徐 楠, 郭家妍, 宋 躍, 唐明睿

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科, 遼寧 沈陽, 110001)

黑色素瘤是一種極具侵襲性的皮膚惡性腫瘤，雖然黑色素瘤的發(fā)病率僅占所有惡性腫瘤的3%左右，但約80%的皮膚癌相關(guān)死亡是由黑色素瘤導(dǎo)致的[1-2]。黑色素瘤易發(fā)生淋巴和血行轉(zhuǎn)移，治療手段有限且預(yù)后極差。程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)是一種翻譯抑制蛋白，可在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲[3-4]。1995年，Shibahara K等[5]在凋亡小鼠細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了PDCD4基因。人類的PDCD4基因定位于染色體10q24, 互補(bǔ)DNA(cDNA)全長約3.5 kb, 其中編碼區(qū)約1.4 kb[6]。PDCD4編碼蛋白約含469個(gè)氨基酸，包含1個(gè)N端功能域(殘基1-140)和2個(gè)串聯(lián)MA3域，其中2個(gè)MA3域分別稱為nMA3結(jié)構(gòu)域(殘基164-275)和cMA3結(jié)構(gòu)域(殘基327-440)[7], 而nMA3結(jié)構(gòu)域、cMA3結(jié)構(gòu)域與真核翻譯起始因子4A(eIF4A)表面結(jié)構(gòu)非常相似[8]。突變分析及核磁共振波譜(NMR)分析表明, PDCD4的2個(gè)MA3結(jié)構(gòu)域均可與eIF4A結(jié)合，抑制核糖體復(fù)合物的形成，抑制RNA解旋酶活性，從而抑制信使RNA(mRNA)的翻譯及蛋白質(zhì)的合成[8-9]。

作為DEAD-box蛋白家族的典型成員, eIF4A具有RNA解旋酶活性，可解開5′非翻譯區(qū)和mRNA帽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)核糖體掃描[10]。當(dāng)eIF4A被PDCD4的2個(gè)MA3結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，其RNA解旋酶活性喪失[7]。研究[11-12]表明，單獨(dú)的cMA3結(jié)構(gòu)域足以抑制RNA解旋酶活性和mRNA翻譯進(jìn)程。短肽是由3～9個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽鏈，是蛋白質(zhì)或多肽消化分解后的片段，部分片段仍具有蛋白質(zhì)或多肽的生物活性。短肽類藥物具有高度選擇性和有效性，且安全性高、耐受性強(qiáng)[13]。相較于傳統(tǒng)小分子靶向藥，短肽類靶向藥物的研發(fā)更容易，制造成本更低[14]。研究[15-17]表明，PDCD4在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)PDCD4將抑制黑色素瘤增殖及侵襲。本課題組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，PDCD4的cMA3結(jié)構(gòu)域可以對B16黑色素瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制作用，而nMA3結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用在B16黑色素瘤細(xì)胞中相對較弱。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)研究PDCD4的cMA3結(jié)構(gòu)域，將cMA3結(jié)構(gòu)域分解為多個(gè)五肽氨基酸序列，其中短肽LVKEI在計(jì)算機(jī)模擬分子對接中參數(shù)較優(yōu)，被定為研究對象。本研究探討TAT修飾短肽LVKEI(TAT-LVKEI)抑制B16黑色素瘤細(xì)胞系增殖及促進(jìn)其凋亡的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

黑色素瘤細(xì)胞系B16購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Bethesda，MD)。該細(xì)胞系于含有10%胎牛血清及抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(Hyclone, Logan, UT)的37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞活力測定

將黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞按每孔2×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中，并在37 ℃下與二甲基亞砜(DMSO)及短肽LVKEI、TAT肽、TAT-LVKEI(5、50、500 μmol/L)共培養(yǎng)48 h。處理后48 h, 更換培養(yǎng)基并加入CCK-8溶液(碧云天)，繼續(xù)在37℃下再孵育4 h。采用全波長酶標(biāo)儀測定450 nm下各孔吸光度值。

1.3 細(xì)胞周期檢測

將黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，并在37 ℃下與DMSO及短肽LVKEI、TAT肽、TAT-LVKEI(5、50、500 μmol/L)共培養(yǎng)48 h。此后將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，離心棄上清，使用預(yù)冷70%體積比(V/V)乙醇固定過夜，按照細(xì)胞周期試劑盒(碧云天)說明配制碘化丙啶(PI)染色液，之后用染色液在37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育細(xì)胞，最后采用流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ, BD)檢測細(xì)胞周期，使用Modfit LT軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 細(xì)胞凋亡測定

將黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，并在37 ℃下與DMSO及短肽LVKEI、TAT肽、TAT-LVKEI(5、50或500 μmol/L)共培養(yǎng)48 h。之后用無乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，使用Annexin V-PI凋亡試劑盒(碧云天)對細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，最后采用流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ, BD)檢測細(xì)胞凋亡情況，使用Flowjo VX軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Western-blotting檢測蛋白表達(dá)

將對照組與處理組的黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，并用含DMSO或100 μmol/L氮烯唑胺(DTIC)的培養(yǎng)基處理48 h。之后于冰上使用RIPA蛋白裂解液[含苯甲基磺酰氟(PMSF)]提取細(xì)胞蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量配平，加入上樣緩沖液進(jìn)行熱變性, -20 ℃保存。配置SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20 μL，電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗室溫孵育1 h后4 ℃過夜，一抗體濃度分別為Cleaved Caspase-3(CST，#9661) 1∶1 000, Bax(CST，#2772) 1∶1 000, Bcl2(CST, #3498) 1∶1 000, β-actin(proteintech) 1∶5 000, 次日復(fù)溫2 h后加二抗室溫孵育1 h, 最后加ECL發(fā)光液于Bio-Rad成像儀獲取條帶照片并使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 短肽LVKEI與eIF4A的計(jì)算機(jī)模擬分子對接

短肽LVKEI與eIF4A蛋白的模擬對接見圖1, 其中白色分子為eIF4A蛋白，黃色分子為單鏈RNA, 紅色為eIF4A抑制劑Rocaglamide, 藍(lán)色為短肽LVKEI。此時(shí)LVKEI與eIF4A蛋白處于最佳對接位置，此位置的對接親和力為-4.4 kcal/mol, 可推測短肽LVKEI可發(fā)揮與eIF4A抑制劑Rocaglamide相同的干擾eIF4A與RNA相互作用的功效。

白色為eIF4A蛋白; 黃色為RNA; 紅色為eIF4A抑制劑; 藍(lán)色為短肽LVKEI。圖1 短肽LVKEI與eIF4A的計(jì)算機(jī)模擬分子對接

2.2 TAT-LVKEI抑制黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞增殖

CCK-8測定結(jié)果顯示，單獨(dú)五肽LVKEI及穿膜肽TAT幾乎不影響細(xì)胞增殖活力，而TAT-LVKEI可顯著抑制B16細(xì)胞的增殖活力，且抑制方式是呈劑量依賴性的。在細(xì)胞周期檢測中，作者選用500 μmol/L TAT-LVKEI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TAT-LVKEI可將B16細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，這與CCK-8的結(jié)果一致。見圖2。

B: 流式細(xì)胞儀檢測DMSO、500 μmol/L LVKEI、500 μmol/L TAT、500 μmol/L TAT-LVKEI處理B16細(xì)胞48 h的細(xì)胞周期結(jié)果;

2.3 TAT-LVKEI誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞

研究結(jié)果顯示, 500 μmol/L TAT-LVKEI處理后可顯著增加B16細(xì)胞的凋亡率(P<0.0001), 而500 μmol/L的短肽LVKEI及TAT穿膜肽處理并未增加B16細(xì)胞的凋亡率。見圖3。

A: 各組B16細(xì)胞凋亡流式圖(n=4); B: 各組流式凋亡分析柱狀圖,與DMSO比較, ****P<0.0001。圖3 TAT-LVKEI誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞凋亡

2.4 TAT-LVKEI對B16細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)蛋白的影響

研究結(jié)果顯示, TAT-LVKEI處理增加了B16細(xì)胞Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平，降低了Bcl2、Ki-67的表達(dá)水平，而DMSO、LVKEI、TAT處理組并未顯著影響凋亡相關(guān)基因，證明TAT-LVKEI具有促凋亡作用。見圖4。

圖4 TAT-LVKEI影響B(tài)16細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)蛋白的印跡圖

3 討 論

黑色素瘤是嚴(yán)重的惡性腫瘤。本研究結(jié)果表明，TAT-LVKEI能顯著抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖活力，將B16細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并能誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡。

在各種人類癌癥中，PDCD4的表達(dá)均有不同程度缺失或減少，如膠質(zhì)瘤[19]、口腔癌[20]、食管癌[21]、肺癌[22]、乳腺癌[23]、肝細(xì)胞癌[24]、胃癌[25]和大腸癌[26]。PDCD4是一種新型的腫瘤抑制因子[3]。過表達(dá)PDCD4可抑制增殖相關(guān)基因Ki-67的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[20，27]; 同時(shí)，過表達(dá)PDCD4可激活Bcl-2/Bax/Caspase-3通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[28-29]。本研究課題組前期研究[18]證實(shí)，黑色素瘤組織中的PDCD4表達(dá)水平顯著低于正常組織，過表達(dá)PDCD4基因或過表達(dá)PDCD4基因的cMA3結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)黑色素瘤B16細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)TAT-LVKEI對B16細(xì)胞具有增殖抑制及促凋亡作用。

基于抑癌基因活性片段合成的短肽已被報(bào)道可抑制乳腺癌細(xì)胞[30-31]、前列腺癌細(xì)胞[32]、卵巢癌細(xì)胞[33]增殖，本研究提取了抑癌基因PDCD4中cMA3結(jié)構(gòu)域的有效短肽片段LVKEI用于測試其抗腫瘤活性，但短肽類藥物普遍存在穿膜性差、半衰期短等缺點(diǎn)[34]。采用穿膜肽、聚乙二醇等修飾手段，短肽藥物可以達(dá)到理想的穿膜性及半衰期[34-35]。本研究對LVKEI短肽進(jìn)行TAT穿膜肽修飾，結(jié)果表明TAT-LVKEI具有一定的抗腫瘤活性，但其是否能夠用于臨床還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。