紀(jì)翠芳 章明敏

肝癌是我國(guó)死亡率位居第二的惡性腫瘤［1］，其主要病因包括乙型肝炎、丙型肝炎、黃曲霉毒素、藍(lán)藻毒素、吸煙、飲酒、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等［2］。肝癌具有起病隱匿，病程短，預(yù)后差等特點(diǎn)［3］，給國(guó)人健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生是在臟腑陰陽(yáng)氣血失調(diào)、正氣虛弱的基礎(chǔ)上，外邪入侵，痰濕、氣瘀、毒等搏結(jié)日久，漸積而成［4］?？笋ツz囊是中醫(yī)傳統(tǒng)肝病治療用藥，主要由三七、牛黃、麝香、蛇膽等十七味中藥組成，主要用于濕、熱、瘀、毒所致各種疾病，臨床上對(duì)肝癌患者具有一定效果?？笋ツz囊在2005年以前所使用的麝香為天然麝香，在2004年以前使用的牛黃為天然牛黃。后來(lái)受?chē)?guó)家政策因素，改為人工牛黃和人工麝香。本研究為考察配方更改前后藥效學(xué)的變化情況，分別設(shè)置KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三組。各組除牛黃與麝香不同外，其他組分及配方均相同。試驗(yàn)分別考察三組克癀膠囊對(duì)人源肝癌細(xì)胞Huh7的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 供試藥：克癀膠囊(深圳同安醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：KHJC-1：171001、180101；KHJC-2：171002、180102；KHJC-3：171003、180103)?？瞻讓?duì)照組：培養(yǎng)基90%DMEM+10%FBS(即完全培養(yǎng)基)。陰性對(duì)照組：含1%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養(yǎng)基。受試藥組：配制KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3分別為濃度640、320、160、80、40、20、10、5 mg/L的含藥培養(yǎng)基。DMEM培養(yǎng)基(gibco公司)。胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)。DMSO(MP Biomedicals，LLC)。胰酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。青鏈霉素溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-2FD)。酶標(biāo)儀(Biotek，型號(hào)：ELX-808IU)。電子天平(日本/島津，型號(hào)：TW423L)。臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：TDZ5-WS)。倒置顯微鏡(廣州粵顯光學(xué)儀器，型號(hào)：XDS-3)。高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：YXQ-LS-50G)。電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DK-8D)。CO2培養(yǎng)箱［上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BPN-150CH(UV)］。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肝癌Huh7細(xì)胞：細(xì)胞代號(hào)：Huh7；來(lái)源：中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2；培養(yǎng)基：90%DMEM+10%FBS。特定突變位點(diǎn)：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)。用MTT比色法檢測(cè)受試藥克癀膠囊對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

1.4 細(xì)胞復(fù)蘇 配戴防凍手套，從液氮罐中取出凍存管，檢測(cè)凍存管密封狀態(tài)，投入37℃恒溫水槽中輕輕搖動(dòng)。1.0～1.5 min后，待溶液解凍后，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中 1000 r/min離心5 min。棄掉上清液，加入了1 ml的培養(yǎng)基反復(fù)吹打使細(xì)胞處于分散懸浮狀態(tài)。按1∶3比例將細(xì)胞懸液接種于新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 ml，輕輕搖勻。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞株(HepG2；Huh7)培養(yǎng)在含有10% FBS、青-鏈霉素的對(duì)應(yīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)基中(pH 7.2～7.4)，置于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。

1.6 試驗(yàn)操作 本試驗(yàn)供試品用不同溶媒進(jìn)行溶解，溶劑選擇：無(wú)機(jī)溶劑：完全培養(yǎng)基、生理鹽水；有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、DMSO。最終DMSO溶解度最佳，故選擇DMSO作為陰性對(duì)照品。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行鋪板，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔5×104個(gè)接種于96孔板中，每孔體積200 μl。邊緣孔不加細(xì)胞，加入同等體積的無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。將96孔板放入5% CO2，37℃條件下孵育24 h。

棄掉舊培養(yǎng)基，按照配制方法分組加入含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)(藥物最終暴露濃度為640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)，每孔體積200 μl，藥物濃度即為終濃度。每個(gè)劑量設(shè)8個(gè)復(fù)孔，于5% CO2、37℃孵育24～72 h，倒置顯微鏡下觀(guān)察藥物的作用效果。

發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)含MTT培養(yǎng)基。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，以確保結(jié)晶完全溶解。

使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以測(cè)得吸光度值(OD)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-給藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。并按中效方程計(jì)算抑制濃度(IC50)值。

1.7 觀(guān)察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)不同濃度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含藥培養(yǎng)基對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用，使用倒置顯微鏡觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化，判斷結(jié)束暴露時(shí)間，并記錄給藥后圖像數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3對(duì)Huh7細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)的MTT結(jié)果未見(jiàn)邊緣效應(yīng)干擾，使用每個(gè)濃度重復(fù)孔數(shù)為n=8進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察 KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3各濃度暴露24 h后，Huh7細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株隨暴露濃度上升細(xì)胞變圓，萎縮凋亡，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，肉眼可見(jiàn)較明顯的量效關(guān)系。細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1，圖2，圖3。

2.2 不同濃度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含藥培養(yǎng)基對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用統(tǒng)計(jì) 不同濃度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3對(duì)Huh7細(xì)胞增殖均有抑制作用，見(jiàn)表1。

圖1 MTT試驗(yàn)中，Huh7細(xì)胞在KHJC-1(劑量組最終濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶劑和完全培養(yǎng)基作用24 h后細(xì)胞形態(tài)圖

圖2 MTT試驗(yàn)中，Huh7細(xì)胞在KHJC-2(劑量組最終濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶劑和完全培養(yǎng)基作用24 h后細(xì)胞形態(tài)圖

圖3 MTT試驗(yàn)中，Huh7細(xì)胞在KHJC-3(劑量組最終濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶劑和完全培養(yǎng)基作用24 h后細(xì)胞形態(tài)圖

表1 不同濃度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含藥培養(yǎng)基對(duì)對(duì)Huh7細(xì)胞增殖抑制作用(，n=8)

表1 不同濃度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含藥培養(yǎng)基對(duì)對(duì)Huh7細(xì)胞增殖抑制作用(，n=8)

2.3 結(jié)果分析 對(duì)于Huh7細(xì)胞，KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3在5-640 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，最高抑制率分別為57.20%、42.32%、56.85%；在作用24 h后的IC50分別為366.72 μg/ml、1762.00 μg/ml、330.78 μg/ml，各劑量組間呈量效關(guān)系，對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞增殖的抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋篕HJC-3＞ KHJC-1＞KHJC-2。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，克癀膠囊的KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三個(gè)配方組對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞均有增殖抑制作用，各劑量組間呈量效關(guān)系?？笋ツz囊對(duì)Huh7人源肝癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋篕HJC-3＞ KHJC-1＞KHJC-2。表明含人工牛黃與人工麝香的克癀膠囊(KHJC-3)比其他含天然牛黃、天然麝香(KHJC-1)或天然牛黃、人工麝香的克癀膠囊(KHJC-2)具有更好的抗人源肝癌細(xì)胞Huh7效果。

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成［5］，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴動(dòng)物藥材牛黃的代用品，具有清熱解毒，化痰定驚的功效。人工牛黃在臨床得到廣泛應(yīng)用，緩解了牛黃供應(yīng)長(zhǎng)期緊張的問(wèn)題［6］。人工麝香屬?lài)?guó)家保密配方，其療效及安全性與天然麝香近似，臨床療效確切［7］，藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)兩者抗炎作用相當(dāng)，可以完全替代天然麝香［8］。本試驗(yàn)結(jié)果充分證明，在改變配方后，克癀膠囊在抗Huh7人源肝癌細(xì)胞方面具有更好的效果。從藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)角度上看，克癀膠囊KHJC-3配方組更具有優(yōu)勢(shì)。這對(duì)于緩解天然牛黃、天然麝香資源緊張狀況具有一定的幫助，同時(shí)也能夠降低企業(yè)成本，降低患者用藥負(fù)擔(dān)，節(jié)約國(guó)家醫(yī)保經(jīng)費(fèi)。對(duì)于促進(jìn)中醫(yī)藥長(zhǎng)遠(yuǎn)、可持續(xù)發(fā)展也具有一定的積極作用。

克癀膠囊由人工牛黃、人工麝香、蛇膽汁、三七、黃芩、黃連、黃柏、大黃等藥材組成。其中三七所含成分三七皂苷(PNS)具有增強(qiáng)免疫的功能，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)化療耐藥等作用［9］。黃芩中含有多種黃酮類(lèi)化合物，包括黃芩素、黃芩苷等，主要通過(guò)抑制端粒酶活性、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等達(dá)到抗腫瘤目的［10］。黃連中所含黃連素能對(duì)肺癌、肝癌、卵巢癌等多種癌癥具有活性，主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等達(dá)到抗腫瘤作用［11］。黃柏中主要成分小檗堿具有良好的抗胃癌、宮頸癌活性［12］。大黃中有效成分大黃素具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在聯(lián)合多種抗腫瘤藥物時(shí)，能夠起到增強(qiáng)療效降低副反應(yīng)的作用［13-15］?？笋ツz囊各組分具有抗腫瘤的協(xié)同作用，其抗腫瘤作用可能為中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)協(xié)同增效的機(jī)理，但其明確的抗腫瘤機(jī)制尚需更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，克癀膠囊的KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三個(gè)配方對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞有增殖抑制作用，各劑量組間呈量效關(guān)系，對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋篕HJC-3＞ KHJC-1＞ KHJC-2。